基于网络药理学的扶正消岩汤抗乳腺癌作用机制的研究*

冯月男，孔祥定,2，肖洪彬，王宽宇,2

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040）

乳腺癌是女性癌症死亡的第二大主要原因，它的发展涉及多种细胞类型的多个过程，其早期诊断是预防这种疾病的最佳方法之一，同时，乳腺癌的诊断和治疗正经历着从“千篇一律”的方法向个性化医学时代转变的过程。中药方剂作为个性化治疗癌症，且具有杀伤癌细胞及提高免疫力等作用而备受关注。随着对中药药理的深入研究，中药治疗癌症的广谱性和低毒性逐渐显现出来。扶正消岩汤是黑龙江中医药大学王宽宇教授临床有效方，研究表明该方治疗乳腺癌有效，且前期实验证明了扶正消岩汤能提高乳腺癌荷瘤小鼠的免疫功能，但由于中药成分复杂，其所起作用的机制仍不明确。本研究拟观察扶正消炎汤对乳腺癌4T1小鼠模型体质量及体内乳腺癌肿瘤生长的影响。

中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）是一个整合了药物代谢动力学、药物化学和药物-靶标蛋白网络-疾病网络的中药系统药理学数据库和分析平台[1]，本研究运用网络药物学方法探寻扶正消炎汤治疗乳腺癌的活性成分、靶基因及信号通略，探讨扶正消岩汤抗乳腺癌的作用机制。

1 动物实验

1.1 实验材料

1.1.1 细胞 乳腺癌细胞株4T1购自中国科学院上海细胞库。

1.1.2 实验动物SPF级健康雌性Balb/c小鼠30只，体质量18～22 g，6～8周龄，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2019-0041。饲养于黑龙江中医药大学安全评价中心，12 h昼夜循环，室温恒定在22～24℃，相对湿度55%～65%，小鼠饲养和使用符合国际动物伦理法，并经黑龙江中医药大学动物伦理委员会批准。

1.1.3 药物 扶正消岩汤，方药组成：党参20 g，白术15 g，陈皮15 g，枸杞子15 g，山萸肉15 g，女贞子15 g，半枝莲10 g，半夏10 g，莪术5 g，白芍10 g，茯苓10 g。上述中药饮片购于黑龙江中医药大学附属第一医院，均符合《中华人民共和国药典》（2015年版）要求；环磷酰胺（江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字H32020857，批号：18050825）。

1.1.4 试剂RPMI1640培养基（美国Hyclone公司，批号：SH3080 9.01）；青链霉素（美国Hyclone公司，批号：SV30010）；胰酶[赛默飞世尔科技（中国）有限公司，批号：25200-056]；二甲基亚砜（北京索莱宝科技有限公司，批号：D8371）；PBS（武汉普诺赛生命科技有限公司，批号：PB18052）。

1.1.5 主要仪器L500型台式低速自动平衡离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；HHS型电热恒温水浴锅（上海博迅实业有限公司）；GSPX-Ⅱ型CO2恒温培养箱（山东博科科学仪器有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 鼠源乳腺癌细胞株4T1置于含1%青链霉素、10%胎牛血清的1640培养基中，于37℃、5% CO2的恒温培养箱中培养，观察细胞贴壁情况，生长状态良好的细胞经0.25%胰酶消化，选取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2 分组与造模 小鼠适应性饲养1周后，将细胞密度为1×107的乳腺癌4T1细胞于每只小鼠腋窝皮下接种0.2 mL，当瘤体积约为5 mm3时即认为成瘤。将30只成瘤小鼠随机分为模型组，环磷酰胺组和扶正消岩汤高、中、低剂量组，每组6只。

1.2.3 实验给药 环磷酰胺组小鼠腹腔注射环磷酰胺，30 mg/kg，扶正消岩汤高、中、低剂量组小鼠灌胃给予扶正消岩汤，生药量分别为20、10、5 g/kg；模型组小鼠灌胃给予等体积生理盐水，1次/d，连续给药2周，2周后脱颈处死取瘤组织进行指标的测定。

1.2.4 观察指标

1.2.4.1小鼠给药前后体质量 小鼠成瘤后给药前称体质量，记为给药前体质量；给药14 d后，脱颈处死各组实验小鼠，称量小鼠体质量，记为取材前体质量；分离各组瘤体，称取瘤质量，并记录取材前体质量－瘤质量。

1.2.4.2抑瘤率 将“1.2.4.1”中记录的瘤质量按照公式计算抑瘤率。抑瘤率计算公式：（模型组平均瘤质量-给药组平均瘤质量）/模型组平均瘤质量×100%。

1.2.5 统计学方法 应用SPSS 25.0统计学软件分析数据，计量资料采用“均数±标准差”（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 网络药理学研究

2.1 扶正消岩汤所含化学成分的收集与药物调控靶标基因预测 以扶正消岩汤中半枝莲、党参、莪术、半夏、陈皮、枸杞、山萸肉、女贞子、白术、茯苓、白芍、当归组成12味中药为关键词通过搜索TCMSP数据库中所含化合物成分和靶基因，遵循药物活性成分筛选条件，优选口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%，类药性（Drug-like，DL）≥0.18的成分为候选活性成分[2]。通过Uniprot（www.uniprot.org）将复方中药对应靶基因转换为标准名称简写。

2.2 乳腺癌疾病相关基因收集 将关键词Breast Cancer录入GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）和OMIM数据库（https://www.omim.org/），收集疾病相关基因。

2.3 构建化合物-靶点-疾病网络 扶正消岩汤作用基因与乳腺癌致病基因取交集，将扶正消岩汤有效化学成分和交集基因导入Cytoscape构建“化合物-靶点-疾病”网络。

2.4 蛋白互作网络（PPI）的构建 为探索靶点蛋白之间的相互作用，把“3.3”取得的交集基因录入在线STRING软件（http://string-db.org），绘制PPI网络图，利用插件CentiScape将置信度设为0.9，得出核心基因[3]。

2.5 GO生物功能富集分析与KEGG通路富集分析 把“3.4”所得的核心基因上传至Cytoscape软件，进行靶点的生物功能富集分析（GO富集分析）和信号通路富集分析（KEGG富集分析）[4]。

3 结 果

3.1 各组小鼠给药前后体质量比较 各组小鼠给药前和取材前体质量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。取材后，扶正消岩汤高、中、低剂量组和环磷酰胺组小鼠体质量增长均高于模型组（P＜0.01或P＜0.05）；扶正消岩汤高剂量组小鼠体质量增长明显高于环磷酰胺组（P＜0.05）；扶正消岩汤中、低剂量组小鼠体质量增长与环磷酰胺组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（见表1）

表1 各组小鼠给药前后体质量比较（±s，g）

表1 各组小鼠给药前后体质量比较（±s，g）

注：与模型组比较，aP<0.05，bP<0.01；与环磷酰胺组比较，cP<0.05

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3.2 各组小鼠瘤质量及抑瘤率比较 扶正消岩汤低、中、高剂量组和环磷酰胺组小鼠瘤质量均低于模型组（P＜0.01或P＜0.05），说明扶正消岩汤和环磷酰胺均可抑制小鼠肿瘤生长，其中扶正消岩汤高、中、低剂量组的抑瘤率分别为51.6%、42.9%、25.1%，呈剂量依赖性；环磷酰胺组抑瘤率为92.3%。（见表2）

表2 各组小鼠瘤质量及抑瘤率比较

3.3 扶正消岩汤有效化学成分分析及化合物-靶点-疾病网络的构建 通过检索TCMSP数据库，建立了包括1 320个化合物在内的扶正消岩汤化学成分数据库，其中符合OB≥30%，且DL≥0.18条件的候选化学成分共186个，合并药味间共有成分，药物有效成分共107个，扶正消岩汤中十二味药共对应11 337个靶点，与有效成分对应的靶点有1 003个。乳腺癌致病基因13 229个，将药物与疾病的基因取交集，共得到117个疾病与药物的交集基因。Cytoscape构建扶正消岩汤“化合物-靶点-疾病”网络。（见图1）

图1 扶正消炎汤与乳腺癌化合物-靶点-疾病相互作用网络

4.4 PPI网络的构建 为了更好地理解扶正消岩汤抗乳腺癌的作用机制，基于PPI关系利用STRING软件构建了相关靶点的PPI网络（见图2）。PPI网络包含117个蛋白质节点，1 105条相互作用关系（连线），其中排在前30的核心基因结果见图3。

图2 扶正消炎汤与乳腺癌的蛋白互作网络

图3 扶正消岩汤防治乳腺癌的核心基因

3.5 扶正消岩汤防治乳腺癌靶标基因功能分析 将117个靶点导入Cytoscape中进行生物信息学分析，经富集分析发现扶正消岩汤治疗乳腺癌参主要通过调节有机环状化合物、激素、脂质、无机物、类固醇激素、化学应激、凋亡信号通路等生物过程发挥作用;在细胞构成中，膜筏所占比例最大；在分子功能中，半胱氨酸型内肽酶活性、DNA结合转录因子活性的正调控、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合、核受体活性关系较大。（见图4）

图4 扶正消岩汤防治乳腺癌作用生物过程分析

3.6 KEGG通路富集分析 经通路富集分析发现扶正消岩汤抗乳腺癌的作用通路有113条，P<0.05有113条，P<0.01有93条通路，评分最高的5条通路的相关基因及评分，见表1。其中PI3K-Akt、癌症中的MicroRNA、MAPK、TNF、NF-κB 5个信号通路是扶正消岩汤主要作用的通路，具体作用基因见表3。

表3 扶正消岩汤抗乳腺癌作用通路相关基因

4 讨 论

扶正消岩汤中党参和半枝莲为君药，半枝莲有清热解毒、散瘀消肿的功效，党参具有补中益气、健脾益肺的功效。现代研究表明党参具有抗癌功效，与半枝莲配伍达到扶正祛邪的双重功效；臣药半夏与莪术具有破血消积、行气止痛的功效，用于癥瘕痞块的治疗，且两者均具有抗肿瘤作用；再臣以白芍养血敛阴止痛，白术益气健脾，扶助正气，共同增强君药扶正祛邪之功；陈皮行气止痛，燥湿化痰，枸杞子、山萸肉、女贞子滋阴补肾，诸味臣药共助君药扶正之功，提高机体整体的抗癌效应；佐药以茯苓利水消肿，亦可增强白术益气健脾功效，具有扶正祛邪之功，当归活血化瘀，补血行气，诸药合用，共奏扶正消岩之功[5-6]。

实验结果显示，扶正消岩汤可以有效抑制小鼠体内乳腺癌肿瘤的生长，且可以促进小鼠体质量增加，同时经网络药理学筛选出扶正消岩汤主要作用于乳腺癌的5条通路，前期实验中对扶正消岩汤干预乳腺癌小鼠的细胞凋亡通路进行了研究，研究结果显示扶正消岩汤可以下调Bcl-2、Caspase-9、VEGF的表达，这与筛选出的PI3K-AKT信号通路中的3个基因相重合，因此，推测扶正消岩汤的抗肿瘤机制可能通过干预PI3K-AKT信号通路来发挥作用。

PI3K-AKT信号通路在肿瘤发生中起重要作用，并能调节关键的细胞功能，包括肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，几乎在所有人类肿瘤（包括乳腺癌）中都发现了PI3K-AKT信号通路的改变[7-10]。PI3K在细胞因子等胞外信号刺激下，使磷脂酰肌醇的羟基磷酸化、激活PIP3，并迅速结合其关键下游靶标AKT，进而使其磷酸化形成有激酶活性的磷酸化p-AKT，活化的AKT通过调控Bcl-2、Caspase-9等下游基因参与肿瘤的形成和发展过程。Bcl-2家族作为PI3K-AKT的下游分子，在调控细胞凋亡的过程中占有重要地位。Bcl-2家族分为抗凋亡和促凋亡两类因子，均在细胞中起协同作用，在细胞凋亡过程中发挥开关的作用，其中抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-xl，主要定位于细胞线粒体外膜，维持线粒体膜的稳定性[11]；促凋亡因子Bax为Bcl-2的显性抑制因子，可与Bcl-2形成异二聚体，从而使Bcl-2抗凋亡能力下降并促进肿瘤细胞凋亡[12-13]。而PI3K-AKT信号能够通过调节Bcl-2蛋白的表达，引起Bax从细胞质向线粒体的外膜移动进而发生寡聚化，促进线粒体外膜上离子通道的形成，使线粒体膜的完整性被破坏，降低线粒体膜电位，最终诱导细胞凋亡[14-17]。因此，了解PI3K-AKT途径对于了解乳腺癌的发展和进程，作为潜在治疗靶点的作用，以及该途径在乳腺癌患者中的预后和诊断价值具有重要意义。下一步我们将对本文分析的结果进行验证，深入探讨扶正消岩汤抗乳腺癌的作用机制，为其新药开发提供实验依据。