湖南不同产地乌药叶4种黄酮类成分的含量测定及其模式识别研究*

易 柳，王瑞颖，高元峰，林丽美，欧阳荣

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410207）

乌药叶为樟科山胡椒属植物乌药Lindera aggregate(Sims)Kosterm的干燥叶，性辛、温，归脾、肾经，具有温中理气、消肿止痛的功效，主治脘腹冷痛、小便频数、风湿痹痛、跌打伤痛、烫伤，其以叶片嫩绿时采摘质量佳[1]。乌药叶药用历史悠久，在历代古文献中多有记载。乌药叶最早收载于唐代《本草拾遗》：“炙研煎饮代茗，补中益气，止小便滑数。”宋《开宝本草》也有记载：“乌药……其叶及根嫩时采作茶片炙碾，服能补中益气，偏止小便滑数。”明《食物本草》曰：“今人采……南烛、乌药诸叶皆可为饮，以乱茶云。”明《本草蒙筌》载：“叶采入剂，下气亦灵。但力迟缓，须醋浸炙。”明《本草纲目》曰：“……乌药以产天台者为胜，其嫩叶炙碾煎饮代茗，补中益气，止小便滑数。”清《医林纂要》云：“温中燥脾，消食杀蛔。治腹中寒痛。”此外，张茂江等[2]对乌药叶的临床应用也有所报道，其常以乌药叶外敷治痈疽、内服治胃痛。

现代研究表明，乌药叶中含有氨基酸与蛋白质、有机酸、甾体皂苷、酚类与糅质、糖类、蒽醌、黄酮、香豆素与萜类内酯、强心苷等化学成分[3-5]。研究[6-11]发现乌药叶主要含有倍半萜类和黄酮类化合物，其中黄酮类化合物是乌药叶发挥药理作用的主要活性物质。然而，现阶段有关乌药叶的研究并不多，且其质量标准未明，极大地限制了其临床运用。故而，本研究采用HPLC同时测定乌药叶中4个主要的黄酮类成分含量，旨在构建湖南省内不同地区乌药叶的指纹图谱并对其进行化学模式识别分析，以期为研究乌药叶后续的药效和作用机制提供物质基础，为提高乌药植物资源的整体利用率提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂 乌药新鲜叶采自湖南省长沙市、湘潭市、益阳市、醴陵市、衡山县等不同地区，共16批样本，皆经湖南中医药大学第一附属医院欧阳荣教授鉴定为樟科山胡椒属植物乌药Lindera aggregate(Sims)Kosterm的叶。不同产地乌药叶样本的采集地和采集时间见表1。

表1 乌药新鲜叶采收地及采收时间

芦丁对照品（批号：wkq19010203，纯度：HPLC≥98%）、金丝桃苷对照品（批号：wkq19040913，纯度：HPLC≥98%）、异槲皮苷对照品（批号：wkq19012403，纯度：HPLC≥98%）、槲皮苷对照品（批号：wkq19031304，纯度：HPLC≥98%）（四川省维克奇生物科技有限公司）；甲醇、乙腈均为色谱纯；磷酸为分析纯；水为超纯水。

1.2 主要仪器Agilent 1260高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Agilent HC-C18(2)（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱（美国安捷伦公司）；DYQC-30型医用超声波清洗机（连云港欧倍洁医疗设备有限公司）；WJX-A400型多功能高速摇摆粉碎机（上海缘沃工贸有限公司）；AE2204电子分析天平（湖南湘仪天平仪器设备有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent HC-C18(2)（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈(A)-0.4%磷酸溶液(B)，梯度洗脱：0~3 min，12%A；3~26 min，12~22.5%A；26~42 min，22.5~24%A；42~45 min，24~12%A。流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；检测波长：343 nm；进样量：10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取真空干燥至恒重的对照品芦丁0.005 8 g、金丝桃苷0.005 8 g、异槲皮苷0.007 2 g和槲皮苷0.005 6 g，分别置于10 mL容量瓶内，加入甲醇，定容，使其配成芦丁0.58 mg/mL、金丝桃苷0.58 mg/mL、异槲皮苷0.72 mg/mL和槲皮苷0.56 mg/mL的单一对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 将采摘的乌药新鲜叶用清水洗净，自然风干，115℃杀青20 min，70℃下干燥7 h，粉碎后过0.45 mm（40目）金属网筛。

精密称取上述干燥的乌药叶粉末1.0 g，置锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，浸泡1 h，称定质量，超声处理1 h，放冷，加甲醇补足减失质量，摇匀，过滤，弃去初滤液，收集续滤液。将续滤液稀释5倍，过0.22 μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性考察 分别取空白溶剂、混合对照品溶液和供试品溶液，在上述色谱条件下依法测定。结果显示，4种对照品色谱峰相应的保留时间处，空白溶剂无干扰，各成分峰形较好且均能达到基线分离，分离度均大于1.5；理论塔板数按槲皮苷计均不低于5 000。

2.3.2 线性关系考察 精密量取混合对照品溶液，将混合对照品溶液用甲醇稀释成一系列的梯度浓度溶液后，按照相应的色谱条件测定。以待测化合物浓度对峰面积进行线性回归，得到各成分标准曲线。结果显示，在定量范围内各化合物的线性良好，各成分回归方程及相关系数见表2。

表2 各成分回归方程及相关系数

2.3.3 精密度试验 精密称取乌药叶样品1.0 g，按上述方法制成供试品溶液，连续进样6次，测得芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮苷峰面积的RSD（n=6）分别为0.60%、1.60%、0.94%、0.46%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 取同一份供试品溶液按照上述色谱条件分别在0、2、4、8、12、24 h进样，测得芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮苷峰面积的RSD（n=6）分别为0.12%、1.20%、1.57%、0.28%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.5 重复性试验 精密称取乌药叶样品6份，每份约1.0 g，按照上述方法平行制备6份供试品溶液，分别进样，测定芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮苷的峰面积，计算RSD值分别为1.82%、1.90%、1.62%、1.17%，表明重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验 精密称取醴陵乌药叶样品6份，每份约1.0 g，精密称定，分别精密加入芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷对照品溶液0.130、0.260、0.375、14.500 mL，再加入甲醇34.735 mL，按照上述方法制备供试品溶液，分别进样，测定芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮苷的峰面积，加样回收率见表3。

表3 各成分的加样回收率测定结果（n=6）

2.4 HPLC法同时测定乌药叶中芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷的含量 将16批乌药叶样本按照“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，并按照“2.1”项下的色谱条件，分别进样，记录芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮苷的峰面积，通过回归方程，计算各样本中芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮苷的含量。（见表4）

表4 不同产地乌药叶药材中黄酮类成分的含量测定（n=3）

2.5 指纹图谱的建立及相似度分析

2.5.1 指纹图谱的建立 取不同产地的16批乌药叶，按“2.2.2”项下样品处理方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样检测，采用“2012版中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，以S1为参照图谱，时间窗宽度为0.1，通过多点校正、全谱峰匹配，得到16批乌药叶指纹图谱共有模式及对照谱图谱，见图1。经匹配后标定了9个共有峰，经过与对照品色谱图及保留时间对比，发现异槲皮苷和槲皮苷峰最为明显。

图1 16批乌药叶指纹图谱图

2.5.2 相似度评价 以对照图谱为参照，对16批乌药叶指纹图谱进行相似度评价，结果16批乌药叶相似度为0.840~0.989，表明相似度良好。（见表5）

表5 不同产地乌药叶生品相似度分析

2.6 化学模式识别分析

2.6.1 聚类分析 应用SPSS 24.0软件，以共有峰的峰面积为变量，进行系统聚类分析。结果显示，16批乌药叶样本可分为4类，Ⅰ类：S3~S4，Ⅱ类：S1、S16，Ⅲ类：S2、S5、S8，Ⅳ类：S6~S7、S9~S15。其中S6~S7、S9~S15均采自湖南益阳地区，由此说明同一产地不同批次样本间差异较小。Ⅰ类中S3、S4分别采自湘潭、长沙；Ⅱ类中S1、S16分别采自醴陵、衡山；Ⅲ类中S2、S5采自衡山，S8采自益阳，Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类中的某些样本虽采自不同地区，却归为同一类，推测可能与不同批次样本的生长环境和采收时间等有关。（见图2）

图2 16批乌药叶聚类分析

2.6.2 主成分分析 应用SPSS 24.0软件对数据标准化后进行主成分分析，首先筛选出特征值大于1且贡献率大于85%的成分，结果发现差异较大的2个主成分的特征值均大于1，其累计贡献率大于85%，即这2个主成分包含了9个共有成分的89.002%的信息，符合主成分分析条件。结果乌药叶第一主成分特征值为6.267，贡献率为69.632%；第二主成分特征值为1.743，贡献率为19.370%（见表6）。碎石图结果显示，上述的2个主成分的坡度较陡，表明这2个主成分是评价乌药叶质量的代表性成分（见图3A）。以9个共有峰的峰面积为变量，导入SIMCA 16.0软件，绘制主成分得分图（见图3B）。结果表明主成分分类结果与聚类分析结果一致，但长沙地区的乌药叶样本不在置信区间内，结合两项分析，说明同一产地不同批次样品间差异较小，不同地区乌药叶的质量仍存在着一定的差异。

表6 乌药叶主成分特征值及累计方差贡献率

图3 16批乌药叶主成分分析结果

3 讨 论

湖南地区的乌药植物资源十分丰富。目前，乌药植物主要取其块根入药[12]，而地上部分的药用价值尚未被开发，出现“湖南乌药作柴烧”的现象，以致乌药植物资源严重浪费。尽管乌药叶在历代文献中多有记载，药用历史悠久，但临床上乌药叶的药用利用率极低。化学成分研究发现，乌药叶中含有多类成分，其中黄酮类成分是其发挥药理作用的主要活性物质，然而乌药叶的质量标准不清。参考其他文献[13-20]，本研究构建了乌药叶黄酮类成分含量测定方法。（1）提取方法考察方面：进行单因素考察，对比了甲醇超声提取与70%乙醇回流提取的区别，发现两种提取方法所得乌药叶中的黄酮类成分含量差异不明显，且超声提取方便、快捷，故而本研究采用甲醇超声法制备供试品溶液。（2）HPLC方法构建方面：①波长方面，考察了250~360 nm波段，发现在343 nm的条件下，基线较稳且峰形最好，最终确定343 nm作为检测波长；②进样量方面，考察了10、20 μL，根据实际需要以及峰形峰宽，确定进样量为10 μL；③柱温方面，考察了25~35℃，根据色谱图峰形、峰高，确定柱温为30℃；④流速方面，考察了1.0、1.2 mL/min，从色谱图峰形、峰高来看，两种流速无明显差异，考虑到色谱柱的使用寿命，最终确定流速为1.0 mL/min。此外，在上述确定的HPLC条件下，我们对乌药叶中的槲皮素和山奈酚也进行了含量考察分析，发现其含量极低，故在本研究中未采用这两个成分作为定量分析的指标。本研究对乌药叶中的4个黄酮类成分进行含量测定，结果显示16批乌药叶样品中各成分的含量高低不同，说明不同地区乌药叶的质量存在着一定差异。

本研究通过分析湖南多个产地16批乌药叶指纹图谱，共确认了9个共有峰，指认了其中2个重要成分，分别为异槲皮苷、槲皮苷。在色谱分析的基础上，采用聚类分析对16批乌药叶样本进行研究，发现具有明显的分类趋势，大致分为4类，其中个别样品与同产地其他批次样品差异较大，这可能与样品采收季节等条件有关。在不同生长时期，植物内各成分的含量随时间变化，这提示着药材需在适宜的时间采收，才能保证药材的质量。我们采用主成分分析筛选出导致样品不同分类差异的主成分，发现这2个主成分的累计方差贡献率为89.002%，说明了前2个主成分能够概括原有数据的绝大部分信息，推测异槲皮苷、槲皮苷对主成分有较大影响，为乌药叶的多成分含量测定提供了依据。