基于糖皮质激素受体介导TGF-β1/Smad3信号轴探讨小青龙汤加减合二陈汤治疗咳嗽变异性哮喘的药效及机制*

任宇哲，万 军，于 宙，杨泽一，杨祥正

（1.北京中医药大学深圳医院，广东 深圳 518100；2.北京中医药大学中医学院，北京 100029）

咳嗽变异性哮喘（cough variant asthma，CVA）是我国临床慢性咳嗽的首要病因，主要症状表现为慢性咳嗽。气候变化、感染、运动均会引起CVA反复发作，严重影响人们的日常生活[1]。当前，临床治疗CVA首选方案为支气管扩张剂与抗炎药联合用药，能够在一定程度上控制CVA患者气道炎性反应，缓解气道痉挛，减少CVA季节性发作，但并不能根治CVA[2]。西药治疗的禁忌证与毒副作用也会在一定程度上影响治疗效果，寻找疗效显著且毒副作用较小的药物是临床治疗CVA的迫切需求。当前研究证实了气道炎症是CVA最主要的病理变化，抑制气道重塑与炎症反应相关靶点可能成为治疗CVA的有效策略[3]。糖皮质激素类药物在哮喘患者局部呼吸道治疗中具有显著功效，其中糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor，GR）可以募集共调节因子并发挥重要的调节作用，调控GR可能是治疗哮喘的重要靶点[4]。基于GR介导TGF-β1/Smad3信号轴可能成为CVA治疗的重要研究方向。中医作为中华民族的传统医学，在疾病的治疗与预防中一直起到重要作用。小青龙汤加减广泛用于儿童CVA临床治疗，其疗效优于西药治疗，且复发率较低。二陈汤多用于CVA药物联用治疗，其疗效与西药相当。两方联用在临床治疗CVA及各类支气管咳嗽中均表现出较好成效，但尚未有两方联用对CVA大鼠药效及作用机制的相关研究。本次研究通过复制CVA大鼠模型探讨小青龙汤加减合二陈汤治疗CVA的药效及机制，旨在为小青龙汤加减合二陈汤治疗CVA提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物3月龄SPF级健康雄性SD大鼠60只，体质量（200±20）g，购自安徽医科大学实验动物中心，合格证号：0001507。在室温22~24℃，相对湿度45%~55%环境中适应性饲养1周，期间自由进食饮水，12 h交替光照，处理方法遵守动物伦理原则，该实验经伦理委员会批准，伦理号：JN.No201 91215S0427210。

1.2 药物与试剂 小青龙汤加减合二陈汤，药物组方：白芍18 g，陈皮、半夏、茯苓各12 g，炙麻黄、干姜各10 g，桂枝9 g，五味子8 g，细辛3 g，甘草6 g。按照处方比例将药物混合，料液1∶10，浸泡2 h。煎煮2次，每次2 h，将2次获得的煎煮液混合浓缩至相应浓度，低温保存备用。卵清白蛋白（美国Sigma，批号：A5253）；布地奈德（AstraZeneca Pty Ltd，批准文号：H20140475，规格：1 mg/2 mL）；IL-4 ELISA试剂盒（武汉菲恩生物科技有限公司，货号：ER0041）；ECP ELISA试剂盒（上海恒斐生物科技有限公司，货号：CSB-E11238r-1）；IFN-γ ELISA试剂盒（武汉菲恩生物科技有限公司，货号：ER0012）；LTE-4 ELISA试剂盒（上海恒斐生物科技有限公司，货号：E-EL-R0588km）；NGF ELISA试剂盒（武汉菲恩生物科技有限公司，货号：ER0054）；兔抗大鼠TGF-β1（英国Abcam，批号：G58011）；兔抗大鼠Smad3（美国SantaCruz，批号：B58031）。

1.3 主要仪器NP-B型生物组织包埋机（Leica公司）；DMLS2型光学显微镜（Leica公司）；Universal HoodⅢ型凝胶成像系统（Bio-Rad公司）。

1.4 造模与分组60只SD雄性大鼠通过随机数字表法分为对照组、模型组、布地奈德组、小青龙汤加减合二陈汤低剂量组、小青龙汤加减合二陈汤高剂量组，每组12只。适应性饲养结束后，除对照组大鼠外，其余大鼠均采用氢氧化铝和卵清白蛋白（OA）激发联合雾化刺激制备大鼠CVA模型[5]。分别于大鼠两后足跖、两腹股沟、颈部、背、腰取10点，每个点皮下注射0.05 mL新鲜配制的致敏液（1 mg卵清白蛋白+100 mg氢氧化铝凝胶+1 mL生理盐水），另外腹腔注射0.5 mL；第8天重复致敏1次；第15天将大鼠置于密闭有机玻璃罩内，给予含1%卵清白蛋白的生理盐水超声雾化激发20 min，共10 d以激发哮喘。大鼠出现明显腹肌收缩、呼吸加快加深等呼吸道痉挛症状提示CVA大鼠造模成功，剔除造模失败大鼠进行后续实验研究，每组最终均保留10只。

1.5 实验给药 小青龙汤加减合二陈汤低、高剂量组大鼠分别配制含生药浓度0.75、1.50 g/mL小青龙汤加减合二陈汤，按照1 mL/100 g剂量灌胃；布地奈德组大鼠采用等量生理盐水配制布地奈德雾化吸入给药，0.42 mg/kg；对照组与模型组大鼠按照1 mL/100 g生理盐水灌胃。连续给药2周，末次给药1 d后处死大鼠。

1.6 观察指标

1.6.1 ELISA法检测血清Th1/Th2类细胞因子水平 末次给药1 d后（禁食不禁水24 h），腹腔注射10%水合氯醛将大鼠麻醉，腹主动脉取血1.5 mL，3 500 r/min离心10 min，取上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测大鼠血清IL-4、嗜酸性细胞阳离子蛋白（ECP）、人γ干扰素（IFN-γ）含量。

1.6.2 ELISA法检测支气管肺泡灌流液中半胱氨酰白三烯（LTE-4）、神经生长因子（NGF）水平 腹腔注射10%水合氯醛将大鼠麻醉，左肺行支气管肺泡灌洗术。分两次进行，第一次灌入4 mL生理盐水，第二次灌入3 mL生理盐水，共计7 mL，并轻揉肺叶1~2 min，回收支气管肺泡灌流液。将两次所得的支气管肺泡灌流液混合均匀，1 500 r/min离心5 min，取上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测大鼠支气管肺泡灌流液中LTE-4、NGF含量。

1.6.3 HE染色法观察CVA大鼠支气管-肺组织形态 颈部脱臼法处死大鼠，经右心室插管至肺动脉，采用生理盐水快速冲洗。取右肺中叶放入10%多聚甲醛中固定，脱水、石蜡包埋，在-20℃条件下冷藏。取平行气道方向进行切片，制得4 μm厚的石蜡切片，HE染色，中性树脂封片，镜检。

1.6.4 Western blotting法检测支气管-肺组织转化生长因子β1（TGF-β1）、Smad3、糖皮质激素受体（GR）蛋白表达水平称取50~80 mg大鼠肺组织，置于匀浆管内，加入600 μL组织裂解液提取总蛋白。BCA法测定蛋白浓度，并将其调整至2.5 g/L。按照试剂盒要求进行上样、电泳、转膜、封闭，TBST洗涤，加入一抗孵育过夜，TBST洗涤，加入二抗孵育30 min，TBST洗涤。将含有目的蛋白的PVDF膜转透明玻璃板，均匀滴加现配的ECL发光液，迅速曝光，并分析图像数据。

1.7 统计学方法 采用SPSS 25.0统计软件进行分析，计量资料采用（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，重复测量资料采用重复测量方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般状况 对照组大鼠反应灵敏、精神活泼，均未出现呼吸急促、困难等症状。模型组大鼠建模后出现躁动不安、打喷嚏等症状，之后出现呼吸急促伴轻度发绀，部分大鼠可闻喘鸣音；重复致敏后反应迟钝、毛色失去光泽。小青龙汤加减合二陈汤低、高剂量组和布地奈德组大鼠建模后症状与模型组大鼠相似，给药后大鼠呼吸急促、喘鸣音等症状均出现不同程度改善，但治疗期间部分小青龙汤加减合二陈汤低、高剂量组大鼠出现体温略高、饮水增多、易斗咬、激惹、食量略微下降等症状，考虑小青龙汤加减合二陈汤中温燥药物较多，大鼠出现阴液损耗等伤阴证候。但大鼠症状普遍较轻，在可控范围内，不会对研究结果产生明显影响。

2.2 各组大鼠支气管-肺组织病理改变情况 对照组大鼠支气管-肺组织结构完整，层次清晰，且无炎症细胞浸润；与对照组比较，模型组大鼠支气管管腔狭窄，基底膜层与平滑肌层变厚，可见明显的炎症细胞浸润；小青龙汤加减合二陈汤低、高剂量组和布地奈德组大鼠可见支气管管腔相对正常，基底膜层与平滑肌层病变程度减轻，炎症细胞浸润减少，且小青龙汤加减合二陈汤高剂量组和布地奈德组大鼠支气管-肺组织病理改变改善效果更佳。

图1 各组大鼠支气管-肺组织病理改变情况比较（HE，×200）

2.3 各组大鼠血清Th1/Th2类细胞因子水平比较 与对照组比较，模型组大鼠血清IL-4、ECP水平明显升高，IFN-γ水平明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，小青龙汤加减合二陈汤高剂量组和布地奈德组大鼠血清IL-4、ECP水平均明显降低，IFN-γ水平明显升高（P＜0.05）；小青龙汤加减合二陈汤低剂量组大鼠血清IL-4、ECP、IFN-γ水平与模型组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；小青龙汤加减合二陈汤高剂量组大鼠血清Th1/Th2类细胞因子水平与布地奈德组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（见表1）

表1 各组大鼠血清Th1/Th2类细胞因子水平比较（±s）

表1 各组大鼠血清Th1/Th2类细胞因子水平比较（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

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2.4 各组大鼠支气管肺泡灌流液中LTE-4、NGF水平比较 与对照组比较，模型组大鼠支气管肺泡灌流液中LTE-4、NGF水平均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，小青龙汤加减合二陈汤高剂量组和布地奈德组大鼠支气管肺泡灌流液中LTE-4、NGF水平均明显降低（P＜0.05）；小青龙汤加减合二陈汤低剂量组大鼠支气管肺泡灌流液中LTE-4、NGF水平与模型组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；小青龙汤加减合二陈汤高剂量组大鼠支气管肺泡灌流液中LTE-4、NGF水平与布地奈德组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（见表2）

表2 各组大鼠支气管肺泡灌流液中LTE-4、NGF水平比较（±s，ng/mL）

表2 各组大鼠支气管肺泡灌流液中LTE-4、NGF水平比较（±s，ng/mL）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

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2.5 各组大鼠支气管-肺组织中TGF-β1、Smad3、GR蛋白表达的比较 与对照组比较，模型组大鼠支气管-肺组织中TGF-β1、Smad3蛋白表达水平均明显升高，GR蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，小青龙汤加减合二陈汤高剂量组和布地奈德组大鼠支气管-肺组织中TGF-β1、Smad3蛋白表达水平均明显降低，GR蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）；小青龙汤加减合二陈汤低剂量组大鼠支气管-肺组织中TGF-β1、Smad3、GR蛋白表达水平与模型组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；小青龙汤加减合二陈汤高剂量组大鼠支气管-肺组织中TGF-β1、Smad3、GR蛋白表达水平与布地奈德组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（见图2、表3）

表3 各组大鼠支气管-肺组织中TGF-β1、Smad3、GR蛋白表达水平比较（±s）

表3 各组大鼠支气管-肺组织中TGF-β1、Smad3、GR蛋白表达水平比较（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

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图2 各组大鼠支气管-肺组织中TGF-β1、Smad3、GR蛋白表达电泳图

3 讨 论

TGF-β1被认为是引起哮喘的主要原因，其能够促进炎性细胞在气道聚集并释放大量炎性因子。同时，能够通过Smad依赖性机制介导血管收缩蛋白内皮素-1分泌与纤连蛋白、蛋白酶、胶原蛋白表达，诱导支气管收缩与气道纤维化[6]。Smad蛋白是TGF-β信号通路中的重要成员，具有调控细胞合成、增殖、分化、凋亡等功效，其中Smad2、Smad3具有促进气道肌成纤维细胞增殖的作用[7]。肌成纤维细胞增殖将导致气道壁增厚、黏性分泌物增多，随着以上病理改变的不断继续，最终将导致肺正常组织被伤痕组织取代，导致气体交换面积减少，机体呼吸能力下降[8]。糖皮质激素类药物是广谱抗炎药物，在局部呼吸道疾病治疗中具有较好的疗效。其抑制哮喘大鼠气道重塑作用机制尚未完全明确，当前研究结果表明糖皮质激素类药物可以抑制哮喘大鼠肺组织TGF-β1通路的炎症蛋白Smad2、Smad3表达，起到改善气道重塑病理变化的效果[9]。

祖国医学将CVA归于“哮病”的范畴，认为其病机在于宿痰伏肺，遇诱因引触，以致痰阻气道，肺失肃降。该病多由肺失清肃、寒痰伏肺所致，需治以化痰平喘、温肺散寒之方。CVA在缓解期患者咳嗽、喘息等症状消失，但肺脾肾气仍不足，需治以纳气平喘、补脾益肾之方[10]。小青龙汤出自《伤寒论》，乃治疗咳喘的经典名方。组方包括麻黄、桂枝、半夏、芍药、干姜、细辛、五味子、炙甘草，其中麻黄、桂枝可祛邪发汗解表，半夏降气化饮，芍药收敛营气，干姜、细辛温化寒饮，五味子降化水饮，甘草调和诸药。全方融温散、温通、温宣于一体，共奏止咳平喘、温肺化痰之效。二陈汤出自《太平惠民和剂局方》，全方由半夏、陈皮、白茯苓、生姜、乌梅、炙甘草组成。方中半夏乃君药，起燥湿化痰、和胃止呕之功。辅以陈皮顺气消痰，佐以白茯苓健脾渗湿，则痰无由生。生姜化痰降逆，乌梅收敛肺气，共助半夏行气消痰之功。加以炙甘草调和诸药，共奏理气和中、燥湿化痰之效。本次研究将两方联用，在原方基础上加味桃仁、地龙，减去干姜、乌梅。现代药理学研究表明地龙有抗过敏的作用，能够松弛支气管平滑肌，起到较好的解痉作用。桃仁活血祛瘀，配合地龙平喘通络、清热定惊，全方共奏温肺散寒、健脾祛湿之效，对应CVA痰湿蕴肺证。

CVA是免疫缺陷引起的变态反应性疾病，Th1/Th2功能失调是CVA发病机制中的重要环节。IL-4是Th2型细胞因子，具有诱导Th2分化，介导气道炎症发展的作用[11]。IFN-γ是Th1型细胞因子，可以诱导Th1细胞分化，并抑制Th2型细胞产生，同时可以激活单核巨噬细胞，抑制气道炎症发展[12]。ECP是主要的炎症反应标志物[13]，观察血清IL-4、ECP、IFN-γ水平变化可以在一定程度上反映机体Th1/Th2细胞平衡状态。LTE-4可以增加毛细血管通透性，促使支气管平滑肌收缩，诱发气道局部炎症，增加黏性分泌物[14]。NGF可以激活免疫系统细胞释放炎性介质，并结合酪氨酸激酶受体（TrkA）增加神经元兴奋性，并诱导神经肽表达，引起气道平滑肌收缩，加重气道炎症[15]。二者均是CVA的重要炎性介质，可以直接反映气道炎症程度，在CVA临床治疗中具有重要的诊断价值。本研究表明CVA发生后大鼠肺组织会发生一系列病理改变，主要表现为基底膜层、平滑肌层变厚与炎症细胞浸润，提示在CVA发生与进展中炎症反应是导致气道重塑的主要原因。CVA大鼠血清IL-4、ECP含量升高，IFN-γ含量降低，提示CVA大鼠Th1/Th2功能失调，机体炎症反应不断扩大。支气管肺泡灌流液中LTE-4、NGF水平上调，提示CVA大鼠肺组织炎症损伤加重。观察CVA大鼠支气管-肺组织TGF-β1、Smad3、GR蛋白表达情况可见TGF-β1、Smad3蛋白表达水平显著提高，GR蛋白表达水平显著下降。研究[16-17]表明，TGF-β1受体在抑制TGF-βR1/Smad2/Smad3通路表达的同时还能促进Acvr11、Smad1/Smad5/Smad8通路表达，降低气道上皮细胞Smad2蛋白磷酸化，同时减少TGF-βR1/Smad2/Smad3依赖性胶原蛋白与弹性蛋白沉积，避免气道纤维化损伤。提示TGF-βR1/Smad3是改善哮喘气道重构的重要靶点。糖皮质激素类药物作用机制在于糖皮质激素与配体GR相结合，将去乙酰化酶-2募集至激活的炎症基因转录复合物逆转激活的炎症基因组蛋白乙酰化，抑制哮喘患者上皮细胞多种炎症基因表达[18]。其中GR可以募集共调节因子并调控转录机制，发挥关键性的调节作用，提示GR是通过调节炎症治疗哮喘的重要靶点。根据以上研究结果推测，GR介导TGF-β1/Smad3信号通路在抑制CVA中起到了关键作用。给予CVA大鼠小青龙汤加减合二陈汤治疗后，大鼠支气管-肺组织病理改变程度明显减轻，TGF-β1、Smad3蛋白表达水平下降，GR蛋白水平升高，提示小青龙汤加减合二陈汤治疗CVA的作用机制可能在于上调GR蛋白表达，并由GR介导TGF-β1/Smad3信号轴，下调TGF-β1、Smad3蛋白表达水平，从而抑制炎性细胞因子产生，起到减轻CVA疾病症状的效果。

综上所述，小青龙汤加减合二陈汤可以改善CVA大鼠肺组织病变，抑制机体炎症反应，其具体作用机制可能与GR介导TGF-β1/Smad3信号轴有关。