R848对哮喘患儿外周血中IFN-γ、IL-33和IgE表达的影响及临床意义

熊蕾蕾，张松林，张向峰，张志英，靳秀红

（郑州大学附属儿童医院、河南省儿童医院、郑州儿童医院南院区呼吸科，郑州450000）

哮喘是一种慢性气道炎症性疾病，在过去几十年来，儿童哮喘的发病率呈显著上升趋势[1]。气道上皮是呼吸道的第一道屏障，受到刺激后可引发Th2型反应，诱导IgE型速发型变态反应，IgE可诱导嗜酸粒细胞和肥大细胞脱颗粒，释放炎症介质，引起气道慢性炎症反应和气道重塑[2]。白细胞介素（IL）-33是Th2型反应中强大的炎症因子，在哮喘中发挥重要作用[3]。T细胞介导的免疫紊乱在哮喘中发挥一定作用，其中包括Th1型细胞产生的干扰素（IFN-γ）。哮喘是免疫因素、基因因素和环境因素等相互作用造成的，Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）在免疫性和炎症性疾病中扮演重要角色，且与哮喘的发生、发展密切相关[4]。有研究显示，TLR4可促进炎症因子的释放，抑制TLR4信号通路的转导和相关炎症因子的表达[5-6]。R848是一种咪唑喹啉，可通过TLR7/TLR8 MyD88依赖性信号通路活化免疫细胞。TLR7通过刺激MyD88途径激活APC，从而导致促炎因子、趋化因子、Ⅰ型干扰素（IFN）及共刺激分子的上调[7]。在大鼠中，R848已显示出抑制炎症反应并消除气道重塑的作用[8]。在本研究中作者通过收集哮喘急性发作期患儿外周血，分离培养外周血单个核细胞（PBMC），检测R848刺激PBMC后对IFN-γ、IL-33和IgE水平的影响，为哮喘的治疗提供新的思路。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2018年6月—2020年5月接受治疗的急性发作期哮喘患者125例，男55例，女70例，年龄4～12岁，及同时期来院就诊的临床缓解期哮喘患者30例，男13例，女17例，年龄3～10岁。纳入标准：（1）急性发作期哮喘患者和临床缓解期哮喘患者的诊断符合《儿童支气管哮喘诊断与防治指南（2016年版）》[9]。（2）近3个月未使用免疫抑制剂和糖皮质激素。排除标准：（1）近1个月有呼吸道感染史或合并其他炎症性疾病。（2）合并免疫系统性疾病。（3）合并过敏性鼻炎。（4）合并血液系统性疾病。（5）合并肿瘤。本研究经过医院伦理委员会批准，家属知情并签署知情同意书。

1.2 外周血PBMC分离 抽取急性发作期哮喘患者和临床缓解期哮喘患者的外周静脉血5 mL，肝素抗凝，加入5 mL Hank′s进行稀释，利用Ficoll进行梯度离心（常温，2 000 r/min，20 min），吸取分离液与血浆间的白膜层。加入3 mL PBS溶液混合均匀，1 500 r/min离心10 min，吸去上清。加入2 mL红细胞裂解液，在室温下孵育5 min，裂解红细胞，1 500 r/min离心5 min，吸去裂解液。加入3 mL PBS溶液混合均匀，1 500 r/min离心5 min，吸去上清。用RPMI1640培养基重悬细胞进行培养，待细胞传2代后冻存待用。

1.3 qRT-PCR检测急性加重期患者PBMC中TLR7/8 mRNA的相对表达水平 Trizol提取PBMC的总RNA，依据反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，进行PCR检测TLR7/8 mRNA的相对表达水平。TLR7上游引物序列为5′-GACCGGTCAAGTCCCAGTGTAGAAC-3′，下游引物序列为5′-TTACTGACTTCATGGCATGTACGGT-3′，TLR8上游引物序列为5′-TACGGGGATCGGCCTTGACTCGCCT-3′，下游引物序列为5′-CCTGGAAATGCGACTGAATGGTTGC-3′，磷酸甘油醛脱氢酶为内参，上游引物序列为5′-GGTACGGTCCGTACGTGATGCCGTAG-3′，下游引物序列为5′-CCGTAGTTGCTAGCTGAATGTGATGC-3′。PCR反应条件为95℃预变性2 min，再变性20 s，60℃退火30 s，72℃延伸35 s，总共40个循环，72℃延伸10 min，利用2-ΔΔCt计算TLR7/8 mRNA的相对表达水平。

1.4 ELISA实验检测IFN-γ、IL-33和IgE的水平 不同浓度R848（0 mg/L、0.1 mg/L、1 mg/L、10 mg/L、100 mg/L）刺激急性发作期PBMC细胞（随机抽取10例患者的PBMC细胞）24 h后检测IFN-γ、IL-33和IgE的水平。根据试剂盒说明进行以下操作：利用鼠抗人IFN-γ、IL-33和IgE抗体包被ELISA板，放置4℃冰箱中过夜，用PBS溶液（含有0.5 ml/LTween20）洗涤1次，再加入PBS溶液洗涤1次，然后放置室温静置1 h。向ELISA板中加入不同稀释浓度的IFN-γ、IL-33和IgE标准品及待检测的样品，放置室温2 h。加入对应的生物素标记的鼠抗人IFN-γ、IL-33和IgE抗体，放置室温1 h。加入底物显色在室温下避光放置30 min，最终加入100 ml/L的硫酸终止显色，用酶标仪检测IFN-γ、IL-33和IgE的含量。

1.5 统计学处理 利用SPSS21.0软件行统计分析，经过正态性检测，符合正态分布的计量数据以±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间的两两比较采用SNK-q检验。非正态分布资料以中位数（四分位间距）表示，组间比较采用非参数秩和检验。Pearson进行相关性检测，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 急性发作期患者外周血中PBMC分泌IFN-γ、IL-33和IgE的水平 急性发作哮喘患者外周血中PBMC分泌IFN-γ的水平低于临床缓解期，分泌IL-33和IgE的水平高于临床缓解期（均P<0.05）。急性发作期患者外周血中TLR7/8 mRNA相对表达水平低于临床缓解期（P<0.05），见表1。

表1 两组外周血中PBMC分泌IFN-γ、IL-33和IgE的水平[±s，M（P25，P75）]Tab 1 Thelevelsof IFN-γ，IL-33 and IgE secreted by PBMC in peripheral blood of two groups[±s，M（P25，P75）]

表1 两组外周血中PBMC分泌IFN-γ、IL-33和IgE的水平[±s，M（P25，P75）]Tab 1 Thelevelsof IFN-γ，IL-33 and IgE secreted by PBMC in peripheral blood of two groups[±s，M（P25，P75）]

注：IL-33：白细胞介素-33；IFN-γ：干扰素-γ；TLR7：Toll样受体7；TLR8：Toll样受体8

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2.2 急性发作期患者外周血中IL-33、IFN-γ和IgE水平与TLR7/8 mRNA相对表达水平相关性分析 急性发作期患者外周血中IL-33水平与TLR7/8 mRNA相对表达水平呈负相关（r=-0.887，P<0.001；r=-0.910，P<0.001），IFN-γ水平与TLR7/8 mRNA相对表达水平呈正相关（r=0.818，P<0.001；r=0.808，P<0.001），IgE水平与TLR7/8 mRNA相对表达水平呈负相关（r=-0.850，P<0.001；r=-0.838，P<0.001），见图1。

图1 IL-33、IFN-γ和IgE水平与TLR7/8 mRNA相对表达水平相关性分析Fig 1 Correlation analysisbetween IL-33,IFN-γand IgElevelswith therelativeexpression levelsof TLR7/8 mRNA

2.3 不同浓度R848刺激急性发作期患者PBMC分泌IFN-γ、IL-33和IgE的水平比较 R848刺激急性发作期患者PBMC细胞后，IL-33和IgE水平在R848 1 mg/L时降低，至R848 10 mg/L后趋于平稳（F=56.231、42.310，均P<0.001）。IFN-γ水平在R848 0.1 mg/L时逐渐升高，至R848 10 mg/L后趋于平稳（F=62.352，P<0.001），见图2。

图2 不同浓度R848刺激急性发作期患者PBMC分泌IFN-γ、IL-33和IgE的水平比较Fig 2 Comparison of thelevelsof IFN-γ,IL-33and IgEsecreted by PBMCof patientswithdifferent concentrationsof R848in theacutestage

2.4 R848刺激急性发作期患者PBMC分泌IFNγ、IL-33和IgE的动态观察 R848 10 mg/L刺激急性发作期PBMC 6~48 h，IL-33和IgE水平在12 h时降低，至36 h后趋于平稳（F=32.658、36.521，均P<0.001），IFN-γ在12 h时增加，至36 h后趋于平稳（F=42.321，P<0.001），见图3。

图3 R848刺激急性发作期PBMC分泌IFN-γ、IL-33和IgE的动态观察Fig 3 Thedynamic observation of R848 stimulatesthesecretion of IFN-γ,IL-33and IgEfrom PBMCin theacutestage

3 讨论

过敏性哮喘是一种影响气道的异质性疾病，其特征是涉及多种细胞和体液介质的慢性炎症反应。典型的哮喘性气道炎症是由IgE依赖性肥大细胞脱粒引发的，并可诱导Th2型细胞因子分泌。这种慢性炎症反应被认为是气道重塑的根本原因，其特征是上皮下基层纤维化，杯状细胞和平滑肌增生[10]。目前哮喘的管理策略一是使用支气管扩张剂（短效和长效2型激动剂）作用于急性加重期和延长缓解时间，二是吸入皮质类固醇以最大程度减少哮喘发作，现已证明控制炎症是治疗哮喘的有效方法[11]。TLR可介导病原体相关分子模式识别，在先天和适应性免疫中都起着至关重要的作用[12-13]。这些广泛表达的蛋白质是第一个参与对环境刺激产生免疫应答的分子，该过程由细胞激活和刺激细胞因子产生介导。已有研究显示TLR2和TLR4的多态性与哮喘的发病相关[14]，致敏的炎症性单核细胞中TLR信号的激活可通过促进Th1相关细胞因子的表达，减弱卵清蛋白诱导的过敏性哮喘[15]。

R848已被证明可诱导从啮齿类到灵长类的许多物种中多种细胞因子的表达[16]。有研究显示在急性哮喘小鼠模型中，R848治疗可以预防肺部疾病的发展，包括气道高反应性和嗜酸性粒细胞增多[17]。对BALB/c小鼠、C57BL/6小鼠哮喘模型的研究发现，R848均表现出抑制急性炎症反应的作用[18-19]。鉴于R848治疗可以预防几种遗传多样的小鼠品系与过敏原激发有关的急性炎症反应，笔者推测该化合物也可以抑制人哮喘的急性炎症反应。因此本研究收集急性发作期哮喘患者的外周血，分离培养PBMC。经过一系列实验检测显示，急性发作哮喘患者外周血中PBMC分泌IFN-γ的水平较低，分泌IL-33和IgE的水平较高，IFN-γ与TLR7/8 mRNA水平呈正相关，IL-33和IgE与IFN-γ及TLR7/8 mRNA水平呈负相关。提示IL-33、IgE和IFN-γ与TLR7/8密切相关，TLR7/8可能通过调控IL-33、IgE和IFN-γ水平参与哮喘的发生和发展。R848处理PBMC后可呈剂量依赖性和时间依赖性的抑制IL-33和IgE的分泌，促进IFN-γ的分泌，发挥抗炎作用。有研究显示TLR7配体可刺激CD4+淋巴细胞和巨噬细胞共培养物中Th1细胞因子IL-12、IFN-γ和IFN-α的产生[20]。对人类细胞的研究表明，R848可以直接诱导效应记忆CD4+T细胞增殖并上调IFN-γ生成[21]。Shen等[22]研究显示，TLR7/8配体R848以剂量依赖的方式抑制鼠脾细胞中抗CD40和IL-4介导的IgE和IgG1的产生，R848对脾细胞抗CD40和IL-4诱导的IgE合成的抑制作用似乎是由至少3种不同的机制介导的。首先，R848抑制了抗CD40和IL-4刺激的脾细胞中B细胞的增殖和分裂。其次，R848促进了IFN-γ和IL-12的产生，而这部分是抑制IgE产生的原因。第三，R848对B细胞具有直接的抑制IgE产生的作用。以上结果均显示，R847对哮喘的炎症反应有一定的抑制作用。

综上所述，本研究结果显示R848可调节急性发作期哮喘患者PBMC分泌的IL-33、IgE和IFN-γ水平，发挥抗炎作用。但具体的作用机制、对于预防慢性气道重塑的影响还有待进一步研究。