脐带采集液中抗生素的合理选择

史丽，郁春艳，李岩，许现辉，杨栋林，沈洋洋，邓为民

（1.天津医科大学基础医学院免疫学系，国家教育部免疫微环境与疾病重点实验室，天津300070；2.协和干细胞基因工程有限公司，天津300384；3.中国医学科学院血液学研究所血液病医院，天津300020）

间充质干细胞（MSCs）是成体干细胞的一种，具有自我更新、高度增殖和多向性分化潜能[1-2]。研究表明MSCs在神经系统疾病、血液系统疾病、糖尿病等疾病的治疗中应用前景广阔[3-10]。目前，骨髓被认为是MSCs的经典来源，人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenehymal stem cells，HUCMSCs）因具有数量丰富、繁殖力强、安全可靠、免疫原性低、治疗疾病种类多、取材方便等优点被认为是替代骨髓源MSCs的理想选择[11-13]。然而在脐带采集过程中，脐带污染的风险较高，因此如何控制脐带污染成为HUCMSCs应用中一个亟待解决的问题。本研究对脐带间充质公共库386份微生物培养阳性标本进行鉴定和药敏分析，选择敏感性较高的抗生素加入培养基中，观察其对HUCMSCs生长、增殖和多向诱导分化的影响，为脐带采集液中抗生素的合理添加提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料 菌株来源为386份脐带采集液微生物培养阳性标本。天津市中心妇产科医院采集的1 562份脐带，放入脐带采集液中保存，送至脐带间充质公共库；HUCMSCs由脐带间充质公共库提供。

1.2 仪器 BacT/Alert 3D全自动血培养仪（法国梅里埃公司）；ATB微生物鉴定及药敏分析仪（法国梅里埃公司）；CO2培养箱（Thermo）；超净工作台（北京冠鹏净化设备有限公司）；OLYMPUS倒置显微镜X70（日本OLYMPUS公司）；MultiskanTM FC型酶标仪（Thermo）；Fj-2008全自动免疫计数仪（西安262厂）。

1.3 试剂与药品 BacT/Alert系统专用需氧厌氧瓶（法国梅里埃公司）；血琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、沙保罗琼脂培养基（天津金正公司）；API系统的细菌鉴定卡与药敏试验卡（法国梅里埃公司）；细胞培养基（DMEM∶F12=1∶1）（GIBCO公司）；青霉素（GIBCO公司）；两性霉素B（GIBCO公司）；头孢西丁、台盼蓝、地塞米松、吲哚美辛、油红O、β-磷酸甘油、2-磷酸-L-抗坏血酸和胰岛素（Sigma公司）。

1.4 方法

1.4.1 微生物鉴定和药敏 脐带采集后放入脐带采集液中保存，然后送至脐带间充质库。注射器抽取12 mL脐带采集液，需氧瓶、厌氧瓶各6 mL进行微生物培养。凡系统报告为阳性瓶时，应从菜单扩展功能项进入观察曲线状态，并及时转种血琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、沙保罗琼脂培养基，置恒温孵箱35℃培养18~24 h。按照标准化操作流程，将细菌或真菌制成菌悬液，接种于相应的鉴定卡和药敏卡，35℃温箱培养18~24 h，其中ATB STAPH药敏卡需培养48 h，读取结果。

1.4.2 HUCMSCs形态、生长和增殖情况 根据细菌及真菌的鉴定和药敏结果选择头孢西丁、青霉素、两性霉素B。随机选取10份标本观察加入的抗生素对细胞生长和增殖是否有影响。将已培养2~3 d生长旺盛的HUCMSCs，用0.25%胰酶消化后，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液（D培养液）将其稀释成1×104/mL，加入24孔培养板，每孔1 mL，置于37℃的5%二氧化碳培养箱中24 h后，吸出培养液。分组处理如表1。倒置相差显微镜下观察各组细胞培养4 d后的形态。再更换培养液第0、1、3、5、7天台盼蓝染色作活体计数，10份标本取均值绘制HUCMSCs的生长曲线。

1.4.3 HUCMSCs体外向脂肪细胞诱导分化 按1.4.2 分5组，取第3代HUCMSCs，按每孔1×104/mL细胞浓度接种于6孔板中，按表1分组加入抗生素。待细胞融合达80%时分别更换为加入成脂诱导液（1μmol/L地塞米松+100μmol/L吲哚美辛+10 mg/L胰岛素+0.5 mmol/L1-甲基-3-异丁基黄嘌呤）的D培养液。每3 d或4 d换液1次，连续诱导3周，去除含诱导液的D培养液，PBS洗涤液洗涤2次，用多聚甲醛固定，油红O染色。另设一空白对照孔为a组，也按每孔1×104/mL细胞浓度接种于6孔板中，只加D培养液，不加诱导液，油红O染色。加入异丙醇作用10 min，洗脱细胞内的脂滴，转移到96孔板，酶标仪490 nm处读取OD值。

1.4.4 HUCMSCs向骨细胞诱导分化 按1.4.2分5组，取第3代HUCMSCs，按每孔1×104/mL细胞浓度接种于6孔板中，用D培养液培养，按表1分组加入抗生素。待细胞融合达80%时分别更换为加入成骨诱导液（0.1μmol/L地塞米松+10 mmol/Lβ-磷酸甘油+50μmol/L 2-磷酸-L-抗坏血酸）的D培养液。每3 d或4 d换液一次，连续诱导4周，其他处理同步骤1.4.3，茜素红染色。另设一空白对照孔为a组，也按每孔1×104/mL细胞浓度接种于6孔板中，只加D培养液，不加诱导液，茜素红染色。

收集成骨诱导分化4周后的细胞培养基，采用放射免疫法检测各组培养基中骨钙素含量。

1.5 统计学处理 使用GraphPad prism 5进行统计学分析并绘图。符合正态分布的计量资料用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 污染菌分布和药敏 微生物培养阳性的386份脐带采集液，共检出细菌及真菌438株。其中革兰阴性菌193株（44.1%），主要为大肠埃希菌；革兰阳性菌210株（48.0%），主要为肠球菌，其次是葡萄球菌和链球菌；真菌35株（8.0%），主要为白假丝酵母菌。转种后检出的主要污染菌分布见图1。其中，4例转种未生长判定为假阳性。56例转种发现有两种微生物污染，其中剖腹产10份，顺产46份。未发现2种以上微生物污染的情况。脐带采集液主要检出菌对3种抗生素的敏感率见表2。

表2 脐带采集液主要检出菌对抗生素的敏感率Tab 2 Sensitivity rate of main bacteria detected in umbilical cord collection fluid to antibiotics

2.2 HUCMSCs形态 各组细胞培养4 d后的形态显示：试验组c组、d组、e组和f组细胞形态良好，为梭形和多角形，涡旋状排列生长，并可见圆形分裂细胞，表明细胞生长旺盛，细胞折光性强，与对照b组相似（图2）。各组进行细胞计数，绘制细胞的生长曲线（图3），各组加抗生素分别与不加抗生素对照组比较，差异均无统计学意义（P=0.57）。结果表明头孢西丁、青霉素、两性霉素B和头孢西丁+青霉素+两性霉素B对HUCMSCs生长和增殖无显著影响。

图2 各组人脐带间充质干细胞培养4 d后的形态（40×）Fig 2 Morphology of HUCMSCsin each group after 4 daysof culture（40×）

图3 各组人脐带间充质干细胞增殖情况的比较Fig 3 Comparison of theproliferation of HUCMSCsin each group

2.3 HUCMSCs向脂肪细胞分化 显微镜下可见细胞胞浆中充满明亮橙红色油滴。试验组b组、c组、d组、e组和f组与对照组a组无明显差别（图4）。酶标仪定量检测细胞内脂滴，加抗生素各组分别与不加抗生素对照组比较，差异均无统计学意义（P=0.89）。

图4 各组人脐带间充质干细胞成脂分化潜能Fig 4 Theadipogenic differentiation ability of HUCMSCsin each group

2.4 HUCMSCs向骨分化 显微镜下可见红色骨结节。试验组b组、c组、d组、e组和f组与对照组a组无明显差别（图5）。检测各组培养基中骨钙素含量，各组加抗生素分别与不加抗生素对照组比较，差异均无统计学意义（P=0.71）。

图5 各组人脐带间充质干细胞成骨分化潜能Fig 5 Theosteogenic differentiation ability of HUCMSCsin each group

3 讨论

本研究通过对386份脐带采集标本的研究发现，共检出细菌及真菌438株。其中革兰阴性菌193株（44.1%），主要为大肠埃希菌；革兰阳性菌210株（48.0%），主要为肠球菌，其次是葡萄球菌和链球菌；真菌35株（8.0%），主要为白假丝酵母菌。

细胞培养时常出现污染现象，常在培养基中加青霉素和链霉素预防污染[14]。本研究发现，大肠埃希菌对头孢西丁的敏感率为90.3%，肠球菌、葡萄球菌、链球菌对青霉素的敏感率分别为93.1%、19.7%、92.9%，真菌对两性霉素B的敏感率为100%。因此，保存脐带的采集液中加入头孢西丁、青霉素和两性霉素B，可有效减少脐带污染。

HUCMSCs的生长曲线和细胞形态均反映头孢西丁、青霉素、两性霉素B和三者混合使用（终浓度均为16 mg/L）对HUCMSCs生长和增殖无影响，也不影响HUCMSCs经诱导向脂肪细胞分化和向骨细胞的分化。头孢西丁的药理机制是通过与一个或多个青霉素结合蛋白（PBPs）结合，抑制细菌分裂活跃的细胞的细胞壁生物合成，从而起抗菌作用。青霉素所含的青霉烷能使细菌细胞壁的合成发生障碍，导致细菌溶解死亡。两性霉素B为多烯类抗真菌抗生素，通过影响细胞膜通透性发挥抑制真菌生长的作用。人体细胞没有细胞壁，仅有细胞膜，头孢西丁、青霉素均作用于细胞壁，故不损害人体细胞。本研究结果提示16 mg/L头孢西丁和青霉素对HUCMSCs形态、生长、增殖和诱导分化无影响；16 mg/L两性霉素B既能抑制真菌生长，又对HUCMSCs形态、生长、增殖和诱导分化无影响。与黄文敬等[15]研究认为两性霉素B在剂量高于30 mg/L时才有细胞毒性结果一致。

综上，本研究证实，保存脐带的采集液中加入头孢西丁、青霉素和两性霉素B（终浓度均为16 mg/L），可有效减少脐带采集细菌和真菌污染，很大程度上避免脐带HUCMSCs因被污染而废弃。本研究可为脐带采集液中抗生素的合理添加提供实验依据，为HUCMSCs的应用提供保障。