增殖诱导配体蛋白的核酸适配体筛选与特异性研究

郑芳芳 林俊生

（1. 泉州医学高等专科学校基础医学部，泉州 362011；2. 华侨大学医学院，泉州 362021）

APRIL是1998年由Hahne等［1］首先发现并克隆成功的肿瘤坏死因子家族新成员，其过表达在多种肿瘤细胞的增殖、存活及肿瘤形成方面有独特作用，体外研究显示可溶性APRIL以剂量依赖方式促进多种肿瘤细胞增殖，且在血清浓度很低的条件下也可促进肿瘤细胞快速增殖［2］。因此，APRIL作为检测肿瘤发生和抑制肿瘤增殖的靶点具有可行性，潘超等［3］的研究也证实了这一点。

2013年，GAO等［4］研制了人源化抗APRIL抗体，可有效抑制肿瘤细胞在体内外的增殖，且具有降低免疫应答的潜能。大量试验研究也表明抗APRIL药物在多种肿瘤治疗方面具有极大的应用前景［5-6］。截至目前已有多项APRIL药物进入临床试验阶段。但APRIL药物研发集中在抗体，抗体具有制备复杂、周期长、不易保存且价格昂贵等缺点，因此，探索一种低成本、制作简便且易保存的APRIL药物是十分必要的。

1990年，Szostak［7］和 Gold［8］两 个 研 究 小组分别独立地提出了指数富集配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）体外筛选技术，通过SELEX技术筛选出的寡核苷酸，我们称之为核酸适配体（aptamer），可与多种类型的靶分子特异性结合，具有分子量小、制备简便、成本低、稳定性高、低免疫原性、易于修饰等优势［9］，目前广泛用于药物输送、生物技术和生化检测方面，尤其在肿瘤标志物、食品安全和环境污染物检测上展现了很好的应用前景［10-12］。本研究旨在利用磁珠-SELEX技术筛选出APRIL蛋白核酸适配体，并鉴定其亲和力和特异性，为后续开展APRIL蛋白生物检测方法的研究和肿瘤药物的研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

80 nt随机起始单链ssDNA文库，两端各为20 nt固定序列，中间为40 nt的随机序列：5-AGCAGCACAGAGGTCAGATG（N40）CCTATGCGTGCTACCGTGAA、FAM-P1：5-FAM-AGCAGCACAGAGGTCAGATG、Biotin-P1：5-biotin-AGCAGCACAGAGGTCAGATG、P1：5-AGCAGCACAGAGGTCAGATG、P2：5-TTCACGGTAGCACGCATAGG、Spacer18-P2：5-poly（dA20）-Spacer18-TTCACGGTAGCACG，相关 DNA和文库由上海生工合成。APRIL蛋白、BAFF蛋白购自南京金斯瑞公司，Dynabeads M-270 Carboxylic Aicd购 自Life Technologies Corporation公 司，Flash Hot Start MasterMix（Dye）购自康为公司，TritonX-100、矿物油购自sigma公司，EM90 oil购自ABIL公司，FastStart Universal SYBR Green Master购自Roche公司，Western印迹相关试剂购自上海碧云天公司，其他试剂为分析纯，实验用水为超纯水。

1.2 方法

1.2.1 EDC/NHS介导的羧基和氨基偶联反应制备蛋白-磁珠复合物 PBS洗涤羧基磁珠4次，加入5 mg EDC和5 mg NHS，室温反应30 min，产物经磁分离洗涤后，加入5 μg APRIL蛋白，室温反应1 h，磁分离洗涤，随后加入1 mol/L乙醇胺封闭30 min，经磁分离洗涤后所得磁珠即为APRIL-磁珠复合物，反筛所用BAFF-磁珠复合物制备方法同上。

1.2.2 乳浊液PCR（emulsion PCR，ePCR）结合长短链引物扩增法制备次级文库 取1 mL EM 90，25 μL Triton X-100和49 mL矿物油配制50 mL EM 90 oil，将文库和EM 90 oil以1∶4（V/V）的比例混合，涡旋混匀，经PCR扩增后获得PCR产物，PCR 程序设置为：95℃，5 min；95℃，60 s，57℃，60 s，72℃，60 s，30个循环；72℃，5 min。将PCR产物高速离心破乳，收集到PCR产物后，加入正丁醇浓缩，弃去上层油层，取下层水相，加入等体积 2×尿素变性上样缓冲液，95℃热变性10 min，冰浴。PCR产物为不等长的双链DNA，带有Spacer18-P2的单链DNA比另一条链长20个碱基，8%尿素变性PAGE可将两条链分开，取PCR产物上样，300 V电泳30 min后，将胶置于紫外灯下观察，带有FAM-P1的链会发出荧光，将发出荧光的目的条带切下，经煮胶分离收集得到单链DNA，再用正丁醇浓缩，弃油层，取水相置于微量透析装置中4℃透析过夜，获得的透析产物即为次级文库。

1.2.3 磁珠偶联法筛选过程 将人工合成适配体文库溶于200 μL结合缓冲液中，沸水煮沸5 min，冰浴10 min，室温恢复10 min，加入到经结合缓冲液洗涤4次的APRIL-磁珠复合物中，室温孵育1 h，洗涤4次后，加入200 μL结合缓冲液，煮沸10 min以洗脱磁珠上的文库，收集到的文库经ePCR大量扩增，长短链法回收后得到次级文库，所得次级文库经核酸定量后，投入下一轮筛选。

1.2.4 斑点印迹（dot blotting）监测筛选进程 取0.5 μL APRIL 蛋白（1 μg/μL）点至硝酸纤维素膜中，同时设立空白对照组；待硝酸纤维素膜干燥后，QuickBlockTMWestern封闭液封闭1 h；将处理好的生物素标记的次级文库加到硝酸纤维素膜上，孵育2 h，Western洗涤液洗膜3次；加入1∶1 000稀释的HRP 标记的链酶亲和素溶液，孵育1 h，洗涤液洗膜 3 次 ；加入 3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB）显色10 min，观察膜片显色情况。

1.2.5 适配体的高通量测序和二级结构预测 利用引物扩增文库（文库和第4、5、6、7轮）后，送安徽昂普拓迈公司进行高通量测序，用DNAMAN进行同源性分析并用在线工具Mfold（http：//mfold.rna.albany.edu/?q=mfold）预测其可能的二级结构。

1.2.6 适配体亲和性和特异性的鉴定

1.2.6.1 斑点印迹 取 1 μL APRIL 蛋白（1 μg/μL）、1 μL BAFF 蛋 白（1 μg/μL）、1 μL BSA 蛋 白（1 μg/μL）点至硝酸纤维素膜中，同时设立空白对照组；待硝酸纤维素膜干燥后，QuickBlockTMWestern封闭液封闭1 h；将处理好的生物素标记的候选适配体加到硝酸纤维素膜上，孵育2 h，Western洗涤液洗膜3次；加入1∶1 000稀释的HRP 标记的链酶亲和素溶液，孵育 1 h，洗涤液洗膜 3 次 ；加入 3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB）显色10 min，观察膜片显色情况，与对照组比较分析适配体的特异性。另取4×1 μL APRIL 蛋白（1 μg/μL）分别点至硝酸纤维素膜中，封 闭 后， 分 别 与 20 ng/μL、50 ng/μL、100 ng/μL、200 ng/μL生物素标记的候选适配体孵育2 h，再与1∶1 000稀释的HRP标记的链酶亲和素溶液孵育1 h，TMB显色后观察膜片显色情况，阳性表明序列具有与APRIL蛋白结合的能力，分析其亲和性。

1.2.6.2 酶联寡核苷酸吸附实验（enzyme-linked oligonucleotide assay，ELONA） 标记生物素的后续适配体作为一抗，HRP标记的链酶亲和素作为二抗，测定适配体特异性：将APRIL蛋白、BAFF蛋白、BSA包被于酶标板，设置空白对照孔，加入等量的包被液，4℃过夜；洗涤液漂洗3次，加入封闭液封闭2 h，洗涤液漂洗3次；加入变性好的一抗，孵育2 h，洗涤液漂洗3次；加入1∶2 000稀释的二抗，孵育1 h，洗涤液漂洗3次；加入TMB显色，读取OD450值。类似的方法测定其亲和力：将APRIL蛋白包被微孔板，与不同浓度（2.5、5、10、25、50、100、200 nmol/L）的一抗反应，获得OD450值。

1.2.6.3 qPCR法测平衡解离常数（Kd） 制备APRIL-磁珠复合物（方法同1.2.1），用等量的APRIL-磁珠复合物分别与不同浓度的候选适配体孵育30 min，热洗脱10 min，磁分离，收集洗脱缓冲液作为qPCR的模板，用qPCR法测定洗脱缓冲液中适配体的拷贝数。

1.2.7 统计学处理 上述Dot blotting、ELONA、qPCR实验均重复3次，采用GraphPad Prism 5统计软件进行数据处理，组间多样本均数采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 SELEX筛选APRIL蛋白特异性适配体

采用磁珠偶联靶标-SELEX方法（图1），经过7轮筛选，从随机ssDNA文库中筛选APRIL蛋白的核酸适配体。先将随机ssDNA文库与偶联有靶标的磁珠孵育，去除大部分未能与靶标结合的ssDNA，再引入修饰后的不等长引物进行乳浊液PCR扩增，通过尿素变性PAGE分离获得ssDNA次级文库。在筛选过程中，优化筛选条件（表1），APRIL蛋白投入量逐渐减少，ssDNA与APRIL蛋白孵育时间逐渐减少，ssDNA投入量第一轮投入1 000 pmol，第二轮及之后调整为200 pmol。第1-3轮通过正向筛选，尽可能地富集能与APRIL蛋白特异性结合的适配体。为了增加筛选到的适配体的特异性，去除文库中的非特异性结合序列，在第4-7轮中引入与APRIL具有高同源性的B细胞活化因子（B cell activating factor，BAFF）蛋白进行负向筛选。

图1 适配体筛选过程Fig.1 Aptamer selection procedure

表1 表1 APRIL适配体筛选条件优化Table 1 Optimization of the selection conditions of the APRIL aptamers

2.2 候选核酸适配体的序列分析和选择

斑点印迹鉴定第2、4、6、7轮的ssDNA次级文库对APRIL蛋白的富集情况，Image J软件分析显示，第2、4、6、7轮的结合率分别为15.6%、20.1%、40.6%、38.9%，可见，随着筛选轮数增加，ssDNA次级文库与APRIL蛋白的结合率逐步增加，而到第7轮结合率比第6轮略低，表明筛选轮数增加不能再提高序列富集程度，可以终止筛选过程。对初始文库和第4、5、6、7轮次级文库进行高通量测序，获得的序列总数分别为11.0340万、16.0346万、141.7842万、203.2927万、127.3063万条，获得的候选序列随着筛选轮数增加，富集程度也一定程度的增加，选择序列中8个频率较高的核酸序列合成（表2）。在线软件Mfold预测这8条候选序列的二级结构，结果显示候选序列均具有茎环结构，且富含鸟嘌呤，其结合自由能（dG）如表2所示，Apt16的dG值最低，Apt3的dG值最高。自由能越低，表明适配体与靶分子的结合亲和力越好，故优先选择Apt16作为候选核酸适配体之一，摒弃Apt3。茎环结构通常被视为核酸适配体与靶分子的识别和结合部位，比较剩余6条候选序列，发现Apt2、Apt10茎环数目最多，进一步比较Apt2和Apt10的鸟嘌呤含量（G%），发现Apt10的G%比Apt2高，说明Apt10比Apt2更易形成G-四联体，故选择Apt10作为另一候选核酸适配体。最终，本研究选择Apt10和Apt16这2条序列作为候选核酸适配体序列（图 2）。

图2 预测候选适配体Apt10和Apt16结构Fig.2 Predicted secondary structures of Apt10 and Apt16

表2 候选序列信息Table 2 Sequences of candidate aptamers

2.3 候选适配体Apt10和Apt16亲和性和特异性分析

2.3.1 Dot-blotting分析适配体特异性和亲和力 生物素标记的候选适配体Apt10和Apt16与HRP标记的链酶亲和素作用，进行特异性分析，结果显示（图3），Apt10和Apt16能够特异性结合APRIL蛋白，TMB显色，出现不同亮暗程度的斑点，且Apt16处的斑点比Apt10处淡，BAFF、BSA和结合缓冲液无斑点出现，说明适配体Apt10和Apt16与BAFF、BSA和结合缓冲液不结合或者极弱结合，表明Apt10和Apt16具有较高的特异性，Apt10比Apt16更高。

图3 斑点印迹法检测Apt10和Apt16的特异性Fig.3 Specificity assays of Apt10 and Apt16 by dot-blotting

候选适配体Apt10和Apt16进行Dot-blotting亲和力分析，结果显示（图4），随着APRIL蛋白浓度降低，TMB显色斑点逐渐变小变暗，当APRIL蛋白浓度低于20 ng/μL时，TMB显色后无斑点出现。

图4 斑点印迹法检测Apt10和Apt16的亲和力Fig.4 Affinity assays of Apt10 and Apt16 by dot-blotting

2.3.2 ELONA 测定适配体的特异性和亲和力分析 候选适配体Apt10和Apt16 进行ELONA特异性分析（图5），结果表明Apt10和Apt16适配体均对APRIL蛋白显著结合，对BAFF、BSA和结合缓冲液无反应性，结果与Dot-blotting试验一致，说明适配体Apt10和Apt16具有显著特异性（P＜0.001）。候选适配体Apt10和Apt16进行ELONA亲和力分析（图6），结果显示吸光度随生物素标记的Apt10和Apt16浓度增加而增加，结果与Dot-blotting试验一致。GraphPad Prism 5软件非线性回归拟合得解离常数Kd。Apt10的Kd值为（18.40±1.47）nmol/L，Apt16的Kd值为（14.61±1.33）nmol/L。

图5 ELONA检测Apt10和Apt16的特异性Fig.5 Specificity assays of Apt10 and Apt16 by ELONA

图6 ELONA检测Apt10和Apt16的亲和力Fig.6 Affinity assays of Apt10 and Apt16 by ELONA

2.3.3 qPCR法测解离常数（Kd） qPCR法测得洗脱缓冲液中适配体的拷贝数，结果显示（图7），洗脱缓冲液中适配体的拷贝数随着Apt10和Apt16浓度增加而增加，结果与Dot-blotting和ELONA结果一致，GraphPad Prism 5软件进行非线性拟合，计算 得 到 Kd，Apt10的 Kd 值 为（365.90±155.60）nmol/L，Apt16的 Kd值 为（328.50±85.77）nmol/L（图7）。qPCR法测得的Kd值与ELONA测得Kd值都在nmol/L范围内，表明筛选得到了亲和力较强的APRIL适配体。

图7 qPCR法检测Apt10和Apt16的亲和力Fig.7 Affinity assays of Apt10 and Apt16 by qPCR

3 讨论

APRIL作为TNF受体家族的重要成员，在体内外肿瘤细胞和组织中高表达，在正常组织低表达或不表达。APRIL可通过膜结合型及可溶型两种形式促进肿瘤细胞增殖［13］。抑制APRIL活性，可有效抑制肿瘤细胞在体内外的增殖，且具有降低免疫应答的潜能［14-15］。目前尚无APRIL适配体药物用于肿瘤的检测与治疗。

SELEX技术作为一种极其有用的分子生物学工具，经过30年的发展，在临床诊断和疾病治疗中取得了巨大的成果，筛选方法也日臻成熟，改进的SELEX 筛选方法层出不穷，但至今仍没有固定的筛选标准［16］。结合实验条件，本研究采用磁珠-SELEX法筛选。磁珠-SELEX是目前筛选最常用且成熟的方法，操作简单，不需要特殊的分离设备，但筛选过程为开放性操作，在磁珠分离、单链制备等过程中，样品与空气接触，只有几十个碱基的分子易形成气溶胶对后续的筛选造成污染，因此本研究引入乳浊液PCR，将水相加入油相中，形成“油包水”乳化剂，每个乳液都可作为一个微反应器，独立平行地进行PCR扩增，避免了模板间的污染，也减少了试剂和样品的消耗［17-18］；筛选过程中单链的分离也至关重要，本研究采用长短链法分离单链，PCR扩增形成的长度不同的单链变性后经尿素PAGE电泳分离，方法直观、效率高，且不影响适配体的结构［19］；在筛选过程中，逐渐加大筛选压力，如调整靶分子和次级文库的投入量，缩短孵育时间等，以获得与靶分子结合力更强的寡核苷酸，第4、5、6、7轮增加反筛步骤，剔除非特异性序列和特异性较差序列，保证筛选的成功率。

筛选获得的适配体能否更好地应用于后续的研究，对其亲和力和特异性进行表征是关键，常见的表征方法有：纳米金比色法、表面等离子体共振法、流式细胞仪、等温滴定量热法、石英晶体微天平法、SYBR Green I染料检测法、qPCR法、Dot-blotting、ELONA等，表征的方法很多，这些的表征方法都有一定的局限性，不同的方法可能会得到不同的结果［20］，因此本研究联合采用Dot-blotting、ELONA、qPCR进行检测，所得的结果是一致的，证明本研究筛选出了特异亲和的APRIL适配体，ELONA与qPCR测得的Kd值不同，可能与检测时对靶分子和适配体处理方法不同有关，如ELONA法出现靶分子与板非特异性结合，qPCR法洗脱过程中洗脱下非特异性结合序列。有研究显示，使用分子模拟技术对获得适配体进行优化，在保留其特异性的基础上可以提高亲和力和稳定性［21］，因此，本课题后续将对核酸适配体Apt10进行模拟优化实验，以进一步研究适配体与靶分子的结合机制，优化适配体，为探索APRIL蛋白检测和拮抗剂研究提供灵敏特异的识别分子。

4 结论

本研究以APRIL蛋白为靶标，采用磁珠-SELEX法进行核酸适配体筛选，筛选过程中优化筛选条件，经过7轮筛选获得富集度高的筛选产物，对产物进行高通量测序，从测序结果中挑选出高亲和力的APRIL适配体Apt10和Apt16，并对其亲和力和特异性进行表征，研究结果表明筛选获得的Apt10和Apt16均能特异性结合APRIL，亲和力均在nmol/L范围内，且Apt10优于Apt16。