叉角厉蝽2个章鱼胺受体的基因克隆及化学农药对其表达的影响

姚琼 全林发 徐淑 董易之 李文景 池艳艳 陈炳旭

（广东省农业科学院植物保护研究所 广东省植物保护新技术重点试验室，广州 510640）

“以虫治虫”是害虫生物防治的主要内容之一，天敌昆虫在控制农业虫害和保证农产品丰产中有不可替代的作用。叉角厉蝽 Eocanthecona furcellata属于半翅目Hemiptera、蝽科Pentatomidae，国内分布于四川、广东、广西、海南、福建和中国台湾地区，国外分布于菲律宾、缅甸、泰国等国［1］。该虫一年发生多代，2龄以上若虫和成虫对害虫均有捕食能力，可捕食鳞翅目 Lepidoptera、鞘翅目 Coleoptera 和半翅目 Hemiptera 等多种农作物害虫，尤其对鳞翅目害虫幼虫表现出较好的控害能力，被认为是一种极具应用潜力的捕食性天敌昆虫［1-2］。

章鱼胺（OA）是无脊椎动物中一种非常重要的生物单体胺，在昆虫体内广泛、大量存在于其中枢神经系统和周缘神经系统［3］。基于果蝇中已得到的章鱼胺受体的结构和信号传递差异，章鱼胺受体分为 3 类 ：α-adrenergic-like（OctαRs），β-adrenergiclike（OctβRs） 和 octopatnine/tyramine（TyrRs）［4］。其中，OctβRs主要通过腺苷酸环化酶活性，诱导胞内 cAMP 的增加，激发蛋白激酶A的酶活性进而转导信号［4-5］。章鱼胺作为神经递质与其受体结合共同参与调节昆虫的嗅觉、产卵、运动、学习和记忆、免疫反应等多种生理功能［3，6-7］。

在害虫综合治理（IPM）中，使用农药控制靶标害虫的同时也可能对天敌昆虫产生毒害作用，使天敌对害虫的控制作用降低。近年来，开展农药对天敌的毒性评价、减轻农药使用过程中对天敌的伤害和协调开展害虫的化学防治和生物防治等逐渐成为IPM研究的热点和重点。但是相关研究主要集中于农药亚致死效应对天敌的发育历期、子代性比、净生殖率和捕食功能等发育生殖和行为的影响，关于杀虫剂对天敌昆虫的亚致死作用的内在分子机制报道较少［8-10］。本研究首次以捕食性天敌叉角厉蝽为实验对象，在该虫转录组数据结果基础上鉴定了2个OctβRs基因，并对其全长进行了克隆；在对其序列特征进行生物信息学分析之后，通过RT-qPCR技术测定了2个OctβRs基因的发育模式以及在亚致死剂量的高效氯氟氢菊酯和毒死蜱处理后的表达变化，以期为阐明OctβRs在叉角厉蝽应激反应中的生理功能研究提供线索。

1 材料与方法

1.1 材料

叉角厉蝽采集自广东省农业科学院白云基地蔬菜园，在温度（25±1）℃，湿度RH（70±1）%、光周期14∶10（L∶D）的养虫室中，以黄粉虫Tenebrio molitor幼虫饲养约3代以上。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取与反转录 收集3-5龄叉角厉蝽若虫各1头，混合用液氮研磨后，利用Trizol试剂提取总RNA，通过2.0%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。采用PrimeScript RT Reagent 试剂盒（Takara）以提取的总RNA为模板反转录得到cDNA第1链，-20℃保存备用。

1.2.2 序列克隆与分析 以叉角厉蝽转录组（数据待发表）测序结果为基础，从成功注释的unigene中搜索章鱼胺受体（Oct）基因序列，将其对应的蛋白序列与NCBI中的nr数据库进行BLASTP，验证是否属于化学感受蛋白。使用Primer Premier 3.0软件根据目的基因片段设计用于 EfOctβ1R 和 EfOctβ2R基因全长序列扩增和表达分析的引物（表1）。分别以2对特异性嵌套引物进行5′和3′RACE扩增。5′RACE 反应程序为 ：94℃ 3 min ；94℃ 30 s，65℃30 s，72℃ 1 min，33 个循环；72℃ 10min；4℃保存。3′RACE 反应程序为 ：94℃ 3 min ；94℃ 30 s，58℃30 s，72℃ 1 min，33 个循环；72℃ 10 min；4℃保存。最后用DNAstar软件将所得序列片段拼接为完整的序列。

表1 本研究中EfOctβ1R和EfOctβ2R克隆及实时荧光定量PCR所需引物列表Table 1 Primers for EfOctβ1R and EfOctβ2R cloning and qRT-PCR used in this study

蛋白分子量及等电点预测使用ExPASy 平台中的 Compute pI/Mw（http：//expasy.org/tools/pi_tool.html），跨膜结构预测使用TMHMM 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）。 结 合 Ballesteros和Weinstein提出的方法，对两条序列上的保守功能结构域和生物胺结合位点进行预测［11］。通过 NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）的 Blast P功能完成氨基酸序列的同源性搜索，利用Clustal W软件对序列进行多重比对的基础上，采用MEGA 5.0 软件中的邻位相连法（neighbor-joining，NJ）构建系统进化树，Bootrap为1 000次。所有从NCBI上获取的序列信息如表2所示。

表2 系统发育分析所用蛋白信息Table 2 List sequence information used in phylogenetic analysis

续表Continuted

1.2.3 药剂处理 前期分别开展了高效氯氟氰菊酯和毒死蜱对5龄叉角厉蝽若虫的室内生物活性测定，经统计分析得高效氯氟氰菊酯和毒死蜱的LC50分别为4.52 mg/L和2.00 mg/L（未发表）。基于此，本研究通过药膜法，以 4.52 mg/L高效氯氟氰菊酯和2.00 mg/L毒死蜱（以丙酮为介质稀释）处理的5龄叉角厉蝽若虫作为处理组；以丙酮处理为对照组。分别于处理后12 h、24 h、36 h、48 h和60 h随机收集处理组和对照组叉角厉蝽各1头，液氮处理后-80℃保存备用，每个样本进行4个生物学重复。样品总RNA的提取与反转录同1.2.1。

1.2.4 实 时 荧 光 定 量PCR 根 据EfOctβ1R 和EfOctβ2R基因序列用Primer Premier 3.0软件设计RT-qPCR 特异性引物。利用GoTaq qPCR Master Mix试剂盒（promega，麦迪逊，美国）进行RT-qPCR。其反应体系包括：10 μL GoTaq qPCR Master Mix，1 μL cDNA 模板，0.5 μL 正向引物，0.5 μL 反向引物，8 μL DEPC水。反应程序：95℃预变性2 min；95℃变性15 s；60℃退火60 s；40 个循环。以EfEF1a基因为内参基因计算相对表达量，数据分析使用比较CT值方法分析［12］。每次RT-qPCR需要3次技术重复，并且每个样本进行4个生物学重复。

2 结果

2.1 荔枝蒂蛀虫EfOctβ1R和EfOctβ2R基因的克隆与序列分析

以叉角厉蝽cDNA为模板进行PCR扩增，得到 EfOctβ1R 和 EfOctβ2R的基因开放阅读框（open reading frame，ORF）长度为1 245和1 230 bp，分别编码414和409个氨基酸（表3）。其蛋白分子量分别为47.34和46.67 kD，二者等电点均大于8，偏碱性，亲水系数为正值，二者均为疏水性蛋白。

表3 叉角厉蝽的章鱼胺受体EfOctβ1R和EfOctβ2R信息Table 3 List of EfOctβ1R and EfOctβ2R in Eocanthecona furcellata

通过TMHMM预测发现其编码的蛋白序列包含有7个跨膜结构域、3个胞外环、3个胞内环、胞内C端和胞外N端，属于典型的G蛋白偶联受体超家族成员。与其他物种同源基因的多序列比对发现，EfOctβRs蛋白序列在跨膜区域保守性较高，EfOctβ1R 和 EfOctβ2R 第 2个和第 3个跨膜结构之间，具有高度保守的两个半胱氨酸残基（图1，图2）。EfOctβ1R 在跨膜结构 3（TM3）后有典型的G蛋白偶联受体保守的DRY结构域，EfOctβ1R 和EfOctβ2R的跨膜结构7（TM7）上具有NP（L/I）IY结构，均是β-adrenergic-like章鱼胺受体中高度保守结构，也是配体诱导内在转化所必需的结构［5，11］。此外，二者序列中存在蛋白激酶C、配体结合位点和糖基化位点等高度保守结构域，跨膜区域的保守性均大于非跨膜区域，并且跨膜域TM5和TM6间的胞内三环是最大的。

图1 叉角厉蝽EfOctβ1R与褐飞虱、赤拟谷盗、果蝇同类蛋白氨基酸序列比对分析Fig. 1 Amino acid sequence alignment of EfOctβ1R in E. furrellata and orthologous receptors from Nilaparvata lugens（NlOctβ1R，ATY68966.1），Tribolium castaneum（TcOctβ1R，NP_001280514.1）and Drosophila melanogaster（DmOctβ1R，NP_001163690.1）

图2 叉角厉蝽EfOctβ2R与跳蚤、褐飞虱、赤拟谷盗同类蛋白氨基酸序列比对分析Fig. 2 Amino acid sequence alignment of EfOctβ2R and orthologous receptors from Cimex lectularius（ClOctβ2R，XP_014254146.1），Nilaparvata lugens（NlOctβ2R，ASA47149.1）and Tribolium castaneum（TcOctβ2R，NP_001280501.1）

2.2 基于叉角厉蝽EfOctβ1R和EfOctβ2R氨基酸序列进化树的构建与同源性分析

基于已报道的其他昆虫种类的同类氨基酸序列基因信息，通过构建系统发育关系来进一步探明EfOctβ1R 和 EfOctβ2R的进化关系。结果显示，所有选中的昆虫章鱼胺受体蛋白形成Octβ1R和Octβ2R两个明显的分支（图3）。与EfOctβ1R同源性最高的同类蛋白为：褐飞虱Nilaparvata lugens NlOctβ1R和 臭 虫 Cimex lectularius ClOctβ1R；与 EfOctβ2R 同源性最高的同类蛋白为：茶翅蝽Halyomorpha halys HhOctβ2R、长红猎蝽 Rhodnius prolixus RpOctβ2R 和臭虫 Cimex lectularius ClOctβ2R。

图3 EfOctβ1R和EfOctβ2R与其他昆虫同类蛋白的系统进化树分析Fig. 3 Phylogenetic analyses of EfOctβ1R and EfOctβ2 R and their homologs in other insects

2.3 表达模式

在叉角厉蝽整个发育周期的不同发育阶段中，均可检测到EfOctβRs基因，但在不同发育阶段该基因的表达水平有所差异，二者在叉角厉蝽成虫期均有较高量表达。EfOctβ1R基因在叉角厉蝽整个若虫期均有所表达，但在3龄若虫期表达最低，仅为卵期表达的0.35倍，在1龄若虫期表达较高，可为卵期表达量的4.90倍；该基因在成虫期表达水平最高，可达卵期表达量5倍以上（图4-A）。EfOctβ2R基因表达模式区别于EfOctβ1R基因，在成虫期表达水平最高，可为卵期的1.97和2.45倍；而在整个若虫期相对表达量均低于卵期表达量，尤其是4龄若虫期呈最低表达水平（图4-B）。

图4 叉角厉蝽EfOctβ1R和EfOctβ2R基因表达模式Fig. 4 Expression pattern of EfOctβ1R and EfOctβ2 R in E.furcellata

2.4 亚致死剂量药剂处理对叉角厉蝽EfOctβ1R和EfOctβ2R基因表达量影响

以亚致死剂量高效氯氟氢菊酯和毒死蜱处理叉角厉蝽5龄若虫，利用RT-qPCR 检测EfOctβ1R和EfOctβ2R基因在处理后5个时间点的表达量变化。结果显示（图5），与空白对照组相比，亚致死剂量的高效氯氟氢菊酯处理后24 h开始，EfOctβ1R和EfOctβ2R基因的相对表达量均陡然上升。在高效氯氟氢菊酯处理后 24 h时，EfOctβ1R 和 EfOctβ2R基因表达上升可高达29和19倍，EfOctβ1R和EfOctβ2R基因在该药剂处理后24 h、36 h和60 h的表达上升倍数之间存在显著性差异。与高效氯氟氢菊酯处理组相似，亚致死课题毒死蜱处理试虫后36 h时，EfOctβ1R和EfOctβ2R基因的相对表达量上升高达23和12倍，而且在该药剂处理后36 h和60 h，EfOctβ1R和EfOctβ2R表达上升倍数之间有显著性差异，说明这两类化学药剂能影响叉角厉蝽EfOctβ1R和EfOctβ2R的表达，二者表达变化不同可能与其不同生理功能相关。

图5 亚致死剂量的高效氯氟氢酯酯和毒死蜱处理后叉角厉蝽EfOctβ1R和EfOctβ2R基因表达量变化Fig. 5 Change in the gene expressions of EfOctβ1R and EfOctβ2R in E. furellata treated with sublethal doses of efficient r-cyhalothrin and chlorpyrifos

3 讨论

生物胺是动植物体内一种弱碱性低分子量含氮化合物，由氨基酸脱羧或醛和酮氨基化形成［3，7，13］。该类物质是一种神经递质或神经调质，通过血淋巴以神经激素的形式作用于靶标器官或组织，对维持生物体的正常生理生化过程及行为有重要意义［7，13］。本研究利用转录组测序和RACEPCR的方法，从叉角厉蝽中克隆出了2个EfOctβRs基因全长序列，为首次从厉蝽属昆虫中克隆同类蛋白序列。自Maqueira等［4］从果蝇中鉴定出了第一个昆虫β-adrenergic-like章鱼胺受体基因起，生物学家们先后从家蚕Bombyx mori［14］、二化螟Chilo suppressalis［15］、 橘 小 实 蝇 Bactrocera dorsalis［16］等多种昆虫中分离鉴定出同类基因。生物信息学分析表明，EfOctβ1R和EfOctβ2R2存在其他昆虫章鱼胺受体预测和证实的磷酸化位点、糖基化位点及配体结合位点等保守的结构域，二者跨膜域TM6上的FxxxWxP序列后紧挨着两个苯丙氨酸残基（FF），该结构是生物胺类受体所特有的结构，均对维持蛋白特有功能有重要意义。据报道，Octβ1R和Octβ2R2在桔小实蝇和二化螟的卵期、幼虫期、蛹期及成虫期虫体内均有所表达［15-16］。本研究发现，EfOctβ1R和EfOctβ2R基因在叉角厉蝽的卵期、若虫期和成虫期呈现不同模式的表达。其中Octβ2R在卵期表达要高于若虫期，而EfOctβ1R则相反，可能与二者在卵期和若虫期的功能不同有关；此外，EfOctβ1R和EfOctβ2R在叉角厉蝽3龄若虫期和4龄若虫期均有一个低量表达，但二者具体生理功能还待进一步研究。

在内外环境不良刺激下，生物体为了应对可能危及体内平衡的各类胁迫，会产生生理或行为上的压力反应［17-18］。研究发现，高温、饥饿和高糖刺激下，黑腹果蝇Drosophila virilis［19］和意大利蜜蜂Apis mellifera［20］体内章鱼胺浓度及活性显著改变；高密度饲养地中海蟋蟀Gryllus bimaculatus［21］和黏虫Mythimna separate［22］体内章鱼胺浓度增加。研究认为在不同逆境状态下，昆虫体内章鱼胺浓度变化，与其应激反应中的生理生化变化及行为调控密切相关。化学农药是昆虫受到的最普遍的外界胁迫刺激之一，Hirashima等［23］证实多种杀虫剂处理美洲大蠊Periplaneta americana后，可引起虫体内章鱼胺的含量显著上升。但是Rachel等［24］证实双甲脒仅能轻微引起意大利蜜蜂血淋巴中章鱼胺含量上升。可见不同作用机制的化学药剂对昆虫章鱼胺含量影响结果不同。近期研究发现，化学药剂不仅影响昆虫章鱼胺含量和活性，也会引起其受体的表达水平变化，但是相关研究报道屈指可数。菊酯类、烟碱类和杀虫肼类杀虫剂均可显著提高埃及伊蚊Aedes aegypti 章鱼胺受体表达水平，扰乱其代谢水平起到杀虫作用［25］。化苯丙酯类和酮类化合物可能通过影响蕈蚊Bradysia procera 章鱼胺受体表达水平，最终起到杀虫和杀卵作用［26］。本研究同样证实了亚致死剂量杀虫剂胁迫后会引起昆虫体章鱼胺受体表达水平的变化。用亚致死剂量的高效氯氟氢菊酯和毒死蜱处理叉角厉蝽后，虫体2个EfOctβRs基因均呈现相对表达量陡然上升，随后表达变化倍数减少的变化趋势，而且2种药剂作用下EfOctβ1R和EfOctβ2R呈现不同程度的变化，其变化区别可能与2种杀虫药剂作用机制不同相关。其中，高效氯氟氢菊酯作用下2个EfOctβRs最大变化出现于药剂作用后24 h，早于毒死蜱处理组（36 h），可能由于对叉角厉蝽而言，高效氯氟氢菊酯药效快于毒死蜱。

使用化学药剂防治害虫的同时，天敌昆虫不可避免遭受药剂毒害。化学杀虫剂对天敌昆虫胁迫研究在协调害虫化学和生物防治中意义重大。杀虫剂对天敌昆虫的发育、行为及生殖影响研究及相关机制是IPM研究热点之一。本研究首次利用捕食性天敌昆虫叉角厉蝽为研究对象，对叉角厉蝽2个EfOctβRs基因进行了克隆及序列分析，并且在其序列特征及表达模式分析结果的基础上，以常用杀虫剂高效氯氟氢菊酯和毒死蜱为处理药剂，对亚致死剂量化学药剂作用后厉蝽中EfOctβRs基因表达情况进行了解析，结果证明EfOctβRs可能参与叉角厉蝽在杀虫剂胁迫下的应激过程，后续可通过RNAi或CRISPR基因编辑等技术在活体水平确定该类蛋白在天敌昆虫应激过程中的相关功能，为该虫在生物学防治中的应用提供理论支撑。

4 结论

叉角厉蝽2个EfOctβRs基因所编码的蛋白包含有7个跨膜结构域和其他昆虫章鱼胺受体证实的磷酸化位点、糖基化位点及配体结合位点等保守的结构域，属于典型的G蛋白偶联受体超家族成员。EfOctβ1R 和 EfOctβ2R基因在叉角厉蝽的卵期、若虫期和成虫期呈现不同模式的表达，对亚致死剂量高效氯氟氢菊酯和毒死蜱有强烈的响应，在叉角厉蝽的化学药剂胁迫响应中行使相应功能。