酿酒酵母TAP42基因在细胞壁应激反应中的作用

崔新刚 孙雅欣 崔晓静 邓雁文 孙恩浩 王俊芳 崔红晶，

（1. 牡丹江医学院，牡丹江 157011；2. 广东医科大学医学分子诊断重点实验室，东莞 523808；3. 广东医科大学第二临床医学院，东莞 523808；4. 广东医科大学基础医学院，东莞 523808）

当酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞处于生长、发育或外环境干扰细胞壁完整性的时候，细胞壁以高度调控和极化的方式被重构，这一过程主要被细胞壁完整性（cell wall integrity，CWI）信号通路所调控［1］。细胞表面感应因子Wsc1-3p、Mid2p和Mtl1p把应激信号传导给小G蛋白（Rho1p），进一步激活丝裂原活化蛋白激酶（the mitogen-activated protein kinase，MAPK）/Slt2p信号级联反应，诱导CWI信号通路，上调靶基因转录，调控细胞壁重构［1］。与经典CWI信号通路相平行，Mpt5p和Ssd1p两条信号通路也参与调控细胞壁生物合成相关基因的转录或转录后加工。因此，在酿酒酵母细胞中有3条信号通路协同调控细胞壁结构和细胞的完整性［2-3］。

酿酒酵母Tap42p（type 2A associated protein-42kD）位于保守性寿命调控通路TOR（target of rapamycin）的下游，作为必需蛋白Tap42p参与抑制或激活蛋白磷酸酶的调控过程，且直接或间接受TOR调控转录［4］。已有研究报道细胞壁应激反应通路中Ssd1p可恢复TAP42基因缺失菌株在高温生长条件下的生长活力，提示TAP42可能参与细胞壁完整性的调控［5］，但其在细胞壁应激反应中的具体作用仍未知。本实验观察TAP42基因对酵母细胞分裂增殖能力的影响，研究TAP42基因在细胞壁应激反应作用，进一步探讨Tap42p参与调控细胞壁完整性信号通路的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 Easy Taq DNA聚合酶（货号：AP111）、HiFi DNA聚合酶（货号：AP131）和DNA分子量标准购自北京全式金生物技术有限公司；酵母提取物（货号：LP0021）和胰蛋白胨（货号：LP0042）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；SD培养基（货号：630411）购自Clontech公司；荧光增白剂（货号：18909）购自美国Sigma公司，按照说明书分别配制成10 μg/mL的工作液。

1.1.2 酵母和载体 酿酒酵母BY4743（MATa/α his3Δ1/his3Δ1 leu2Δ0/leu2Δ0 LYS2/lys2Δ0 met15Δ0/MET15 ura3Δ0/ura3Δ0）和载体 pRS306 为实验室保存。载体为低拷贝穿梭载体，在大肠杆菌中具有氨苄青霉素抗性，分别带有Ura营养筛选标签。引物由上海英骏生物技术有限公司合成（表1）。

表1 本实验所用引物序列Table 1 Nucleotide sequence of primers used in this study

1.2 方法

1.2.1 TAP42基因缺失菌株的构建与验证 构建方法参照文献进行［6］。以载体pRS306为模板，TAP42-F和TAP42-R为引物，PCR扩增TAP42基因破坏元件。采用醋酸锂方法将破坏元件转化进野生型酵母细胞（BY4743），经Ura营养型缺陷培养基筛选。PCR鉴定阳性克隆基因组DNA，鉴定引物分别为TAP42基因开放阅读框外侧引物（V-TAP42-F/V-TAP42-R），TAP42基因开放阅读框内部鉴定引物（TAP42-int-F/TAP42-int-R）以及营养筛选标签URA3基因内部引物和TAP42基因开放阅读框外侧引物（URA-int-F/V-TAP42-R），采用Easy Taq DNA聚合酶，反应体系和反应条件参照说明书进行。

1.2.2 生长曲线 实验方法参照文献进行［7-8］。制备300 μL 含酵母细胞的葡萄糖蛋白胨酵母膏（yeast extract peptone dextrose，YPD）新鲜培养物（含10 μg/mL荧 光 增 白 剂（calcofluorwhite stain，CFW），A600值约为0.04，30℃、180 r/min振荡培养24 h；每间隔2 h 全自动生长曲线分析仪（Bioscreen C MB system，Finland）测定标本A600值。根据吸光度值，计算酵母菌株的细胞分裂增殖活性，并绘制生长曲线图。3次独立重复实验。

1.2.3 点板实验 取等量的酵母菌株新鲜培养物（A600值约为0.25），无菌水倍比稀释（1∶10），取3.5 μL稀释培养物滴入实验组YPD培养平板（含10 μg/mL CFW）［9］。倒置 30℃培养，从第 2天起每隔12 h观察菌落形态，并拍照。3次独立重复实验。

1.2.4 定量RT-PCR 将酵母菌株培养至对数生长期，收集1 mL酵母菌株新鲜培养物（A600值约为2.5），提取酵母细胞总RNA、制备cDNA，以及实时定量PCR方法均参照试剂盒说明书进行。定量PCR实验数据以酵母PRP8基因为参比，根据2-ΔΔCT法计算细胞壁应激反应通路中效应基因的转录水平。

1.2.5 统计分析 采用SPSSS 19.0统计软件。两组间的比较采用t检验；以P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 TAP42基因缺失菌株的鉴定

破坏元件转化野生型酵母细胞（BY4743），PCR验证阳性克隆酵母细胞基因组DNA，结果显示：引物V-TAP42-F和V-TAP42-R所扩增片段大小为1 678 bp；引物TAP42-int-F和TAP42-int-R所扩增片段为164 bp；引物URA-int-F和V-TAP42-R所扩增片段为712 bp，结果与预期大小一致（图1）。实验结果表明，TAP42基因缺失菌株（BY4743 tap42Δ）构建成功。

图1 TAP42基因缺失酵母菌株的验证图Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of PCR products on verifying the TAP42 deletion strain

2.2 TAP42基因缺失菌株的分裂增殖能力

通过点板实验和全自动生长曲线分析仪检测酵母细胞增殖能力，研究TAP42基因缺失对酵母细胞分裂增殖能力的影响。结果显示：与BY4743菌株比较，tap42Δ菌株形成的较小克隆，细胞增殖活力较差（图2-A）；与BY4743菌株平均约12 h达到对数生长期比较，tap42Δ菌株平均约18 h达到对数生长期，细胞增殖活力较差，提示缺失TAP42基因抑制酵母细胞分裂增殖能力（图2-B）。以上结果说明缺失TAP42基因减弱酵母细胞的分裂增殖能力。

图2 酵母细胞的分裂增殖能力Fig. 2 Cell proliferation ability of the yeast strains

2.3 TAP42基因缺失酵母菌株的细胞壁应激反应抗性

为进一步研究tap42Δ菌株在细胞壁应激反应中的作用，本实验观察在含细胞壁应激反应诱导剂培养条件下的细胞克隆形成能力和生长活力。结果显示：在YPD培养基条件下，与BY4743菌株的克隆形成能力和细胞增殖活力比较，tap42Δ菌株的分裂增殖能力明显减弱；在细胞壁应激反应（含10 μg/mL CFW）条件下，与BY4743菌株的克隆大小比较，tap42Δ菌株的克隆形成能力无明显差异（图3-A），两菌株的生长均受到抑制，与BY4743菌株平均约20 h达到对数生长期比较，tap42Δ菌株平均约21 h达到对数生长期，细胞增殖活力无明显差异（图3-B）。以上结果说明缺失TAP42基因增强酵母细胞对细胞壁应激反应的抵抗性。

图3 酵母菌株的细胞壁应激反应抗性Fig.3 Resistance to the cell wall stress response of the yeast strains

2.4 细胞壁应激反应通路中转录因子的表达水平

为研究tap42Δ菌株参与细胞壁应激反应通路的可能机制，本研究采用定量qRT-PCR检测参与细胞壁结构和完整性调控通路中转录因子SWI4、SWI6、MPT5和SSD1的表达水平。结果显示：在正常生理条件下，与BY4743比较，tap42Δ菌株中SWI4、SWI6、MPT5和SSD1基因表达明显升高；在细胞壁应激反应条件下，与BY4743比较，tap42Δ菌株中SWI4基因表达上调，MPT5基因表达下调（图4）。因此，缺失TAP42能诱导细胞壁应激反应通路中转录因子SWI4、SWI6、MPT5和SSD1的表达水平。

图4 酵母菌株中 SWI4、SWI6、MPT5 和 SSD1 基因定量表达水平应激反应抗性Fig.4 Expression levels of SWI4, SWI6, MPT5 and SSD genes in yeast strains

3 讨论

本研究采用一步基因置换法，基于基因同源重组的原理［10-11］，在二倍体酵母细胞BY4743菌株中敲除TAP42单倍体基因，保留另一单倍体基因在酵母细胞中的活性。结果发现，缺失TAP42基因减弱酵母细胞分裂增殖能力，提示Tap42p对酵母细胞的正常分裂增殖来说是必需的，推测Tap42p参与酵母细胞分裂增殖能力的调控。已有文献报道Tap42p以不依赖TOR功能的方式调节细胞的分裂增殖能力，进而调控果蝇生存活力；敲除Tap42蛋白的果蝇诱导JNK信号通路，激活Caspase信号通路，最终导致细胞死亡［12］。以上结果均说明TAP42基因参与单细胞真核生物酿酒酵母和多细胞真核生物分裂增殖能力的调控。

酿酒酵母Tap42p是TOR寿命调控信号通路中下游靶蛋白之一，TOR激酶与蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）、PP2A样催化亚基Sit4和Pph21/22之间竞争性调控Tap42p磷酸化或非磷酸化的活性形式［3］。因此，TOR激酶可直接或间接地调控Tap42p的功能，使其在细胞应激反应［5，13］、自噬作用［14-15］和生长发育［16-17］等生物过程中发挥着重要的作用。

本研究通过观察tap42Δ菌株在细胞壁应激反应条件下的细胞分裂增殖能力，研究Tap42蛋白在细胞壁应激反应中的作用。结果发现，细胞壁应激反应诱导剂处理后的BY4743和tap42Δ酵母细胞的生长均受到抑制，但tap42Δ酵母细胞增殖活力与野生型酵母细胞接近，提示tap42Δ菌株对细胞壁应激反应有一定的抗性。我们推测可能原因是单倍体TAP42基因转录本在调控tap42Δ菌株细胞壁结构和细胞完整性方面具有重要的代偿性功能；也可能与Tap42p具有两种活性形式，协同调控细胞活性相关，磷酸化Tap42p作为PP2A磷酸酶活性的抑制剂，而非磷酸化Tap42p作为其激活剂，分别通过转录因子Msn2/4、Gln3和Rtg1/3信号通路诱导核内靶基因的上调表达，参与调控细胞应激反应过程，进而改善细胞应激适应能力［13］。本研究进一步也发现缺失TAP42基因诱导细胞壁应激反应通路中转录因子SWI4、SWI6、MPT5和SSD1表达上调，推测上调保护性CWI、Mpt5和Ssd1信号通路赋予tap42Δ菌株对细胞壁应激反应的抵抗性，可能原因与上调的信号通路协同调控细胞壁结构和细胞完整性，参与细胞壁重塑功能，抵抗细胞壁应激损伤相关。已有研究报道SSD1基因恢复tap42Δ菌株在高温生长条件下的存活力［5］，也提示上调细胞壁应激反应通路中转录调控因子的水平能改善tap42Δ菌株在热应激条件的存活能力，这一研究结论也佐证了本研究关于上调细胞壁应激反应信号通路的活性赋予tap42Δ菌株对细胞壁应激反应抗性的推测。

酵母细胞壁是一种坚固而富有弹性的结构，对维持细胞形状和完整性及促进细胞周期进展至关重要。当细胞内外物理化学环境发生变换时，可能诱导经典细胞壁完整性（CWI）信号通路中蛋白激酶C-丝裂原活化蛋白激酶（PKC-MAPK）的激活，诱导转录因子Rlm1p、Swi4/6p和Skn7p的表达水平，参与下游靶基因的转录调控［2］，进一步调控β-葡聚糖和细胞壁相关成分，参与细胞壁重构，赋予细胞应激抵抗能力［1，18］。在调控细胞壁重构这一过程中，两个转录后调控因子Mpt5p和Ssd1p，以不依赖MAPK/Slt2p方式参与细胞壁生物合成方面的调控，或通过间接机制改善细胞壁完整性［2-4］。综上，本研究结果推测缺失TAP42基因诱导SWI4、SWI6、MPT5和SSD1保护性信号通路上调可能赋予菌株对细胞壁应激反应的抵抗性，但具体的作用机制有待进一步研究。

4 结论

通过构建TAP42基因缺失酵母菌株研究其克隆形成能力和细胞分裂增殖能力，以及在细胞壁应激反应中的作用，结果表明缺失TAP42基因减弱酵母细胞分裂增殖能力，形成较小克隆。研究结果推测上调细胞壁应激反应通路中转录因子的表达水平能增强TAP42基因缺失酵母菌株对细胞壁应激反应诱导剂的抵抗性，但具体作用和作用机制有待进一步研究。