生物样品中唾液酸和神经节苷脂的测定

摘要：神经节苷脂属于神经鞘脂类，结构中含有一种或多种唾液酸，是神经细胞膜的重要组成成分。神经节苷脂和唾液酸都是具有生物活性的化合物。由于它们具有生物相关性，因此与每种基质相对应的分析方法也都得到了一定的发展。本文就生物样品中适用于唾液酸和神经节苷脂的主要分析方法做一下总结概述。

关键词：生物样品 ;唾液酸;神经节苷脂

神经节苷脂是一类含有唾液酸的酸性鞘糖脂 ，是神经细胞膜的重要组成成分，结构中含有一种或多种成分的唾液酸，更确切的说，神经节苷脂是由鞘氨基醇与脂肪酸相结合，然后通过酰胺键连接到包含一种或多种唾液酸的低聚糖链上。在物理条件下，唾液酸分子中含有一个负电荷，通常以低聚糖，糖脂或糖蛋白的形式存在。近年来，随着对细胞膜表面糖类生理功能研究的日益重视，神经节苷脂的研究也日趋受到科学界的关注，特别是随着神经生物化学和神经药理学的发展，对神经节苷脂的代谢及其生物学作用研究已经成为神经科学的重要课题。神经节苷脂在国内大多数依赖进口，虽然国内外已报道了多种分离纯化的方法，但大多都有操作步骤繁琐、溶剂用量大等不足之处。目前国内外的研究主要集中于其与生物膜其他有效成分之间的相互作用，而对神经节苷脂的分离方法的最佳选择未给予详细的报道。因此，本文就多种分离纯化方法做一下比较总结，对其分离过程起到一定的帮助。

一、 唾液酸的测定

1.分光光度法

应用最广泛的分光光度法是由Svennerholm发明的，后人对这种方法又做了一定的修正，即用阴离子交换法来提高纯度。采用这种方法时在蔗糖与间苯二酚之间发生反应。由于唾液酸是糖脂类神经节苷酯物质所含有的特征基团，因此当与间苯二酚反应生成紫色复合物可用于神经节苷脂的含量测定。本法主要用于人体组织和生物体液的检测，但一些研究者已经将其用于乳制品检测当中，如牛奶制品和婴儿奶粉的检测。

2.液相色谱法

液相色谱法也是测定唾液酸较常用的方法，当样品没有被衍生化的时候，最常用的方法就是紫外检测离子对的方法。这种方法最初是由Spyridiaki与Siskos联合研究出来的]，他们通过实验模拟提高了以下物质检测时的溶出度，包括Neu5Ac，Neu5Gc，N-乙酰基-9-O-乙酰神经氨酸等。在分析中使用了多种亲脂的阳性离子对，如四辛基溴化铵（TOA-Br）三異丙醇胺（TIP），或者三乙醇胺（TEA）等。使用时一般选用TIP，因为它的强度和分离度更好，但在操作中必须要注意PH的控制，（最佳值为3.5），这是决定因素。但是实验发现，当这种方法应用到血清、尿液、唾液当中时，只能区分两种形式的唾液酸（Neu5Ac and Neu5Ac2en），在纯化步骤中必须除去蛋白质。由于其限制条件较多，因此在分析结构较多的唾液酸混合物时不推荐使用本方法。

3.气相色谱法

气象色谱法（GC）与质谱法联用起初是用来鉴定苷脂键及衍生反应后的氧代神经氨酸，Zanetta等人在此基础上研究了一种非常有效的方法，用来测定唾液酸标准液及生物体液如马血清及牛、羊、马的下颚下腺粘蛋白等]。这种方法是在无水甲醇和使用七氟酸酐形成的挥发性衍生物存在的前提下，通过重氮甲烷酐的甲基酯化进行气相色谱/质谱电子轰击的。这种方法能够区分大部分的唾液酸，包括O -酰化的Neu5Ac，Neu5Gc和8-O-邻甲基和8 - O -硫酸衍生物以及1，7 -唾液酸内酯。在后面的研究中，这个研究小组对本方法做了小的修改，从而对单糖、脂肪酸和氨基酸在人的粘蛋白和尿素当中可以更好定位。样品仍可以用相同的反应容器，并按照分析唾液酸的方法用GC /质谱进行分析。相对于上面的方法，本法的测定范围更加全面，其应用前景也更加广泛。

二、神经节苷脂的测定

总神经节苷脂量可以通过分离纯化唾液酸内容物来定量，量化结果可以用脂键联合唾液酸的方式表达。

1.质谱分析测定

质谱（MS）能够利用薄层色谱与高效液相色谱板来鉴别及定量神经节苷脂，虽然这种方法的灵敏性较TLC/HPTLC免疫染色法低，但这两种方法都可以作为薄层扫描法测定神经节苷脂的补充方法。薄层色谱法与快原子轰击（FAB）及质谱连用的优点归因于FAB-MS与气相、液相及超临界流体色谱仪是从生物反应表面得出结果的最有效方法。TLC-FAB-MS连用效率高且省时，但条件是仍然需要大分子的解吸附来增加灵敏度，并尽量减少基质中离子源的污染。因此，这种方法对样本的要求很高，在实际的应用中也会受到一定的限制。

2.液相色谱法与质谱法联用

近几年，一项液相色谱法与质谱法连用的技术逐步发展起来，实验证明，这种方法能够用于牛奶及婴儿配方中的神经节苷脂中GD3 和 GM3的测定。其GD3与GM3的重现性分别小于5%和14%，其覆盖范围在83%到87%之间。由于本法的重现性比较低，所以不建议直接应用，在进一步研究及改进之后，相信本方法会成为一种可靠的分析方法应用到实际操作中去。

三、结论

分光光度法不仅可以将生物试样中的唾液酸进行定量分析，还可以将总神经节苷脂量进行分析测定，因此现在仍然是主要的分析方法。其应用方式主要为脂类与唾液酸的联合应用。而色谱技术能够将两种主要结构的唾液酸进行区分，这种方法不仅可以测定样品的原始数据还可以检测在临床环境中唾液酸代谢情况的变化（如癌症的早期诊断）。

神经节苷脂在生物试样中的检测都需要一系列冗长的准备工作，如提取、分离以及纯化工作，但这又是最关键性的操作步骤，因为这些步骤可以从根本上反应出实际的损耗，要将所有干扰源消除非常困难，只能尽量减少。所以在分析过程中，一定要认真将此前期工作认真准备。

神经节苷脂测定的未来趋势是利用质谱分析来阐释所有结构的神经节苷脂、糖链、脂肪酸以及鞘氨基醇，并且调节他们的生物活性。本文对多种分析方法做了分析与比较，为神经节苷脂的开发利用提供了理论和一定的实验依据，这就是分析所有鉴别方法的意义所在。

参考文献

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作者简介：

高静（1985.09--），女，汉族，山东淄博人，工程师，硕士研究生，主要从事药物化学、制药工程等研究