人溶瘤腺病毒的研究进展

申祖杰 王艳杰 康燕燕 林楠 高剑文

摘 要 溶瘤腺病毒是一种经过人工改造的，可以特异性杀伤肿瘤细胞的一类腺病毒。常用的腺病毒为致病力弱的人血清2型或5型腺病毒。该病毒对正常机体的细胞无明显不良反应，但是可以特异性地在肿瘤细胞中大量增殖、裂解肿瘤细胞和破坏肿瘤微环境。在溶瘤腺病毒的作用下被感染的肿瘤细胞释放出大量的肿瘤特异性抗原，进而激发全身性的抗肿瘤免疫反应，最终达到治疗肿瘤的目的。溶瘤腺病毒治疗肿瘤不良反应小、精度高、抗干扰能力强，具有广阔的运用前景。

关键词 溶瘤腺病毒 肿瘤 免疫疗法 联合用药

中图分类号：R979.19 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2021）21-0076-05

Research progress of human oncolytic adenovirus

SHEN Zujie1， WANG Yanjie2， KANG Yanyan2， LIN Nan2， GAO Jianwen2

（1. Shanghai Sunway Biotechnology Co.， Ltd.， Shanghai 201206， China； 2. Shanghai Medical Staff University， Shanghai 200135， China）

ABSTRACT Oncolytic adenovirus is a type of human adenovirus that is artificially modified and can specifically kill tumor cells. Commonly used adenovirus is human adenovirus serotype 2 or serotype 5， both are weakly pathogenic adenoviruses. This virus has no obvious adverse reactions to normal body cells， however， it can specifically proliferate in tumor cells in large quantities and lyse tumor cells and destroy the tumor microenvironment. Under the action of oncolytic adenovirus， the infected tumor cells release a large number of tumor-specific antigens， which ultimately stimulate a systemic anti-tumor immune response， and finally achieve the purpose of treating tumors. Oncolytic adenovirus for the treatment of tumors has small adverse reactions， high precision and strong anti-interference abilities and may have broad application prospects.

KEy wORDS oncolytic adenovirus； tumor； immunization therapy； drug combination

恶性肿瘤是目前威胁人类生命健康的重大疾病之一，是继心血管疾病的世界第二大死因，全球有近1/6的死亡是由癌症造成的，且近十几年来恶行肿瘤的发病率每年呈现约3.9%的上升态势，死亡率每年呈2.5%的上升态势，防控形势极其严峻[1]。目前针对肿瘤的治疗主要包括手术治疗、放射治疗、化学治疗、中医中药治疗和生物免疫疗法等5种，其中生物免疫疗法逐渐展现出其治疗优势。溶瘤腺病毒疗法属于生物免疫疗法范畴，是通过分子生物学的方法，人为改造腺病毒的基因组结构，使该病毒特异性地感染肿瘤细胞，而不对正常细胞造成威胁的一种新型治疗方法[2]。至今世界上已有2种腺病毒类肿瘤药物上市，分别为复制缺陷型人p53注射液（商品名：今又生），和人腺病毒5型注射液（商品名：安柯瑞），其中安柯瑞是世界上首个上市的溶瘤腺病毒药物[3]。目前世界范围内有20多种腺病毒相关肿瘤药物处于临床试验阶段，且治疗及临床数据结果表明，溶瘤腺病毒治疗效果明显，不良反应小，具有极其优势的应用前景。本文将着重从腺病毒的生物学特性、作用机制、溶瘤腺病毒类型、新药研发进展、治疗策略以及未来的发展方向及问题等方面加以阐述。

1 腺病毒分类及分子特性

腺病毒是首次从人腺体细胞发现并分离到的无包膜、双链DNA、大小约为70～90 nm的一類病毒。人腺病毒根据其病毒颗粒表面表位的不同分为6个亚属，57个血清型。不同血清型的腺病毒，致病性及感染部位具有很大的区别，其中基因治疗和溶瘤病毒常用的是C亚属的2型和5型人腺病毒。人腺病毒2型和5型遗传背景清楚、重组方法成熟，是研究较为详细的人类腺病毒。腺病毒基因组为线性双链DNA，其两端各有1个100～600 bp的反向终端重复序列（inverted terminal repeat， ITR），其内侧包含腺病毒早期复制相关的E1-E4基因，和晚期表达的结构相关的L1-L5基因[4]。其中E1区和E3区与病毒的复制特性以及免疫逃避功能相关，是常被用来敲除和改造的区域。E1区分为E1A和E1B，E1A主要由289R和243R构成，主要调节细胞的代谢功能而使细胞更易感，E1B 55K基因产物可以与细胞中的p53蛋白相互作用，使其丧失功能，进而阻止p53基因表达产物诱导的宿主细胞分裂停止或细胞凋亡的产生，此外E1B 55K基因产物还与病毒复制、病毒晚期mRNA的转录以及病毒RNA的转运等有关。E3区域基因表达产物的主要功能是破坏免疫防御机制，而与病毒基因组的复制无关，其中gp19K蛋白可以在内质网上与主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex， MHC）I类分子的重链结合而阻止其转运到细胞表面、延缓MHC I的表达，进而破坏被感染细胞的免疫防御机制，而使病毒大量复制，最终裂解细胞[5]。

2 目前常见溶瘤腺病毒的类型

2.1 自然筛选型溶瘤腺病毒

有些病毒具有天然的肿瘤靶向作用，如腺病毒、细小病毒、呼肠孤病毒、腮腺炎病毒、新城疫病毒等，人们通过特异性筛选这些病毒作为治疗工具来治疗肿瘤[2]。1956年美国国立癌症研究所开展了对30名宫颈癌患者采用不同血清型的野生腺病毒的肿瘤治疗临床研究，结果显示，半数以上患者的肿瘤缩小，但该实验只显示了局部治疗效果，出于对野生筛选型腺病毒的安全性及未知隐患的考虑，该方法当时未被广泛推广。直到1996年有研究表明，带有E1B 55 K基因突变的腺病毒可选择性地在p53缺陷的肿瘤细胞中复制，从而引起了人们对腺病毒的再次广泛关注[6]。

2.2 非转导靶向型溶瘤腺病毒

该方法主要是通过分子生物学的方法，特异性删除腺病毒的毒性基因如55 kD以及免疫逃避相关基因如gp19K，从而降低腺病毒的毒性，或将其毒性基因替换为免疫监查位点基因如程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1， PD1）、细胞程序性死亡配体1（programmed cell death 1 ligand 1， PDL1）或其他相关基因如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor， GM-CSF）、白介素-2（interleukin-2， IL-2）、甲胎蛋白（alpha fetoprotein， AFP）等[7]，或者将腺病毒启动子替换为肿瘤特异性启动子如TERT等。其中GM-CSF基因较为常用，其表达产物的重要作用是刺激粒细胞、单核巨噬细胞的成熟，并继发其多种功能。1996年Onyx公司的溶瘤腺病毒dl1520在《科学》杂志发表，同年上海三维生物技术有限公司基于Onyx-015抗癌理论研发出了目前国内唯一上市的溶瘤病毒药物人腺病毒5型注射液（商品名：安柯瑞）。日本Oncolys公司的Telomelysin TM（OBP-301）溶瘤病毒是删除了E1A区前端的启动子并替换上了TERT肿瘤特异性启动子，从而使得该腺病毒可以在肿瘤细胞中特异复制，并对正常细胞无明显不良反应[8]。溶瘤腺病毒CG0070插入了肿瘤特异性启动子TERT和GM-CSF基因，从而使得改造后的溶瘤腺病毒可以特异性地在肿瘤细胞内复制，伴随肿瘤细胞的裂解会释放出GM-CSF因子和肿瘤特异性抗原，从而刺激人体全身性抗肿瘤免疫反应[9-10]。

2.3 转导靶向型溶瘤腺病毒

转导靶向型溶瘤腺病毒相对于非转导靶向型溶瘤腺病毒，其肿瘤特异性更强，安全性更高，且易于体内清除。其原理是在删除或替换了腺病毒的某些毒性基因的同时，人为改造并优化了其抗原表位结构域，如fiber蛋白的RGD，从而减少了其感染正常细胞的几率，降低了治疗的不良反应。目前，进入临床Ⅱ期的DNX-2401溶瘤腺病毒，其原理是在E1A区缺失了24 bp碱基，因此其可以特异性地在RB基因突变的肿瘤细胞内复制，同时对该腺病毒Fiber基因的Hloop区段进行了RGD修饰，从而使得修饰后的溶瘤腺病毒可以与特异性表达整合素αvβ3和αvβ5的脑胶质瘤细胞结合并发挥作用[11]。

3 腺病毒溶瘤作用机制

腺病毒进入机体后，对肿瘤的作用有4个：第一是直接杀伤作用。正常细胞清除病毒的信号通路包括IFN、TLR、JAK-STAT、PKR等[12-13]，当病毒感染正常细胞后，该通路被激活，进而结合免疫反应达到清除病毒的目的。癌细胞相比于正常细胞，其信号传导及内环境平衡存在异常，当诸如RAS、TP53、RB1和PTEN等基因发生突变后，使得癌细胞更易被病毒感染[14]，因此通过删除腺病毒与该类蛋白相互作用的非必需基因，如E1区55 kD基因的腺病毒，可以使其选择性地在肿瘤细胞中大量增殖并裂解肿瘤细胞[9]。第二是介导肿瘤免疫反应。腺病毒可以打破肿瘤的免疫逃避机制，即当腺病毒感染肿瘤细胞后，其在细胞内表达的病毒蛋白，以及干扰细胞的正常代谢而产生的异常蛋白与肿瘤表面的组织相容性复合体Ⅰ类抗原形成复合物，从而改变肿瘤表面抗原特性、介导T淋巴细胞识别并特异性攻击感染了病毒的肿瘤细胞[15]。第三是肿瘤免疫清除作用。当溶瘤腺病毒感染并杀伤肿瘤细胞及其基质细胞后，会使肿瘤细胞裂解并释放出大量的肿瘤特异性抗原（tumor specific antigen， TSA），从而激起全身性的抗肿瘤免疫反应。第四是载体作用。腺病毒在删除某些毒性基因的同時可以作为载体插入目的基因，在目的基因的表达产物与溶瘤腺病毒的协同作用下，诱导细胞毒性T淋巴细胞、NK细胞等对肿瘤细胞的免疫杀伤作用，增强机体的抗肿瘤免疫反应。

4 已上市及进入临床的溶瘤病毒药物

全世界首个溶瘤腺病毒新药在2005年被批准上市，以鼻咽癌为主要适应证的人腺病毒5型注射液（商品名：安柯瑞），该药为中国原研药，其治疗肿瘤效果明显、不良反应小、安全性高。目前，中国处于临床试验研究的溶瘤腺病毒药物为成都康弘生物科技有限公司的选择性溶瘤重组腺病毒注射液KH901，处于临床Ⅱ期招募阶段，其主要适应证为头颈部肿瘤。国外关于溶瘤腺病毒治疗药物的临床研究共44个，主要分布于欧洲、美国和加拿大，其中处于临床Ⅰ期的试验共25个，处于临床Ⅱ期的试验共11个，处于临床Ⅲ期的试验1个。具有代表性的是Cell Genesys公司开发的溶瘤腺病毒药物CG0070，目前该药物已处于临床Ⅲ期，主要治疗非肌肉性浸润膀胱癌[16]；DNAtrix公司的溶瘤腺病毒DNX-2401，目前处于临床Ⅱ期，该药的主要机理是利用avb3或avb5进入宿主细胞，进而治疗脑胶质瘤[11]；ángel Montero Carcaboso设计的溶瘤腺病毒VCN-01，对抗视网膜母细胞瘤，并对眼癌具有良好的治疗效果[17]。

5 治療策略

目前，溶瘤腺病毒治疗的给药方式主要为瘤内注射，静脉注射给药方式较少，因为静脉注射往往会引起机体强烈的免疫反应，使得病毒感染肿瘤细胞之前已被免疫系统排除殆尽而达不到溶瘤目的，因此单次或多次瘤内、瘤外精确用药，使其特异性裂解肿瘤细胞，激发机体抗肿瘤免疫反应，是主要的治疗方式[18]。有报道临床上先通过手术摘除膀胱癌肿瘤，再通过导管将溶瘤腺病毒（CG0070）注射到膀胱，起到了较为理想的治疗效果[16]；DNX-2401局部给药后治疗脑胶质瘤的效果明显[11]。安柯瑞结合经动脉化疗栓塞术，通过经肿瘤动脉注射H101的方式，可以有效治疗不可切除性的肝细胞癌[19]。因此，摸索不同溶瘤病毒的最佳给药方式，精确给药，对溶瘤病毒的治疗效果至关重要[20]。

由于溶瘤腺病毒为可复制性腺病毒，因此其抗干扰能力强，可以协同放化疗、单抗治疗、细胞治疗、中药治疗等多种治疗方法。如预注射表达IL-7/IL-12的溶瘤病毒，极大增强了PD-1抗体和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4， CTLA-4）抗体的治疗效果[21]。有报道称，表达IL-15的溶瘤腺病毒Ad-E2F/IL15与细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte， CTL）治疗方法连用，对肿瘤的治疗效果明显大于单独使用CTL或者Ad-E2F/IL15，具有潜在的临床应用价值[22]。溶瘤病毒ONCOS-102联合PD1治疗难治性晚期黑色素瘤，观察到患者血液中促炎性细胞因子如IL-6、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor， TNF）α、IFN-γ等系统性增加，并引起了强效的全身性抗肿瘤免疫反应[23]。H101联合化疗可以有效治疗晚期肿瘤[24]。

使用溶瘤病毒的治疗策略多种多样，使用溶瘤腺病毒治疗时，要根据具体肿瘤的类型、肿瘤灶的部位，肿瘤的扩散程度等合理用药，因此更科学的治疗方法仍需要探索，但从初步治疗效果可见，其治疗效果较为理想。

6 拟解决问题及展望

腺病毒作为溶瘤病毒载体具有极大的潜力，给恶性肿瘤的治疗带来了新的思路与希望，但目前仍有许多问题需要解决，如肿瘤特异性问题。目前上市或在研的产品中，绝大多数为特异性瘤内复制型溶瘤腺病毒，部分正常细胞虽然感染后不利于溶瘤腺病毒的复制，但是会表达毒性因子并引起不良反应，因此寻找广谱性肿瘤特异性靶点并设计出能够特异性感染肿瘤细胞的溶瘤腺病毒，是未来研究的一个方向。

目前溶瘤腺病毒给药方式多为瘤内注射，但机体深处的肿瘤如脑胶质瘤，很难直接瘤内注射，该用药方式极大限制了溶瘤腺病毒的临床应用范围，为了解决该难题，静脉注射给药是一个治疗思路，但是，由于静脉注射极易引起强烈的免疫清除反应，被血液稀释后的病毒很难精确浸润到肿瘤部位，静脉高剂量注射溶瘤腺病毒存在潜在安全风险如细胞因子风暴等问题，因此，探索新的给药方式，新的载体形式，降低机体免疫反应，是溶瘤腺病毒未来急需解决的一个问题。

为了提高对肿瘤的选择杀伤性，降低不良反应，选择肿瘤特异性启动子是一个设计思路，虽然该办法可以明显提高溶瘤病毒的特异性，但是由于启动子的活性普遍较低而使得溶瘤腺病毒在肿瘤细胞中增殖能力较弱，进而大大降低了其溶瘤效果。因此寻找特异性强，活性高的肿瘤特异性启动子是未来研究的一个方向。

作为溶瘤病毒类产品，同时要考虑生物安全性问题，如改造后的病毒是否稳定，是否与野毒重组而形成新的自然界未有的病毒，携带的基因是否可以稳定表达，至今无数据支持。改造的病毒执行功能后，是否可以被机体完全清除，治疗过的患者是否会成为传染源而感染正常人等问题，需要精确的检测方法和相应的安全性评价体系。有报道称cidofovir（CDV）可以有效阻止OBP-301溶瘤腺病毒的体内复制，因此寻找抗病毒药物是提高溶瘤腺病毒安全性的一个设计思路[25]。

虽然腺病毒易于进入细胞，在被感染的细胞内可以充分持续的表达外源基因，且不易整合到宿主基因组，但是腺病毒的基因组大小约为33 kb，外源基因载量小，约为5 kb，因此极大地限制了其溶瘤病毒的应用范围。

综上所述，溶瘤腺病毒虽然存在一些问题亟待解决，但其治疗效果值得肯定，是一种有前途的肿瘤免疫疗法。目前，优化溶瘤腺病毒的构建、降低其临床的毒性、建立高效递送体系、建立安全可靠的生物安全评价体系，是急需解决的问题。单一溶瘤腺病毒疗法可能较为局限，溶瘤腺病毒疗法与其它肿瘤疗法的联合运用，是未来运用的一个方向。随着人们对肿瘤和病毒的不断认识，不断引进新的设计理念，注重生物安全，相信溶瘤病毒具有广阔的应用前景。

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