羊抗人载脂蛋白A1多克隆抗体的制备及免疫佐剂优化

邓碧华　姚明霞　周明旭　卢宇　徐志伟

摘要：载脂蛋白A1（ApoA1）是预测冠心病（ASCVD）最有价值的指标之一。从人血浆中通过PEG沉淀法提取ApoA1，经过纯化和验证后，选择不同佐剂进行乳化，以不同免疫程序接种成年湖羊，制备羊抗人载脂蛋白A1多克隆抗体。通过琼脂扩散试验定期检测免疫后羊血清中抗人ApoA1多克隆抗体的效价，比较不同佐剂的免疫效果。结果显示，CV13佐剂与弗氏完全佐剂结合免疫后，抗体效价达到或超越弗氏佐剂组，明显优于ISA206佐剂。本研究结果可为国内医药企业自主制备高质量羊抗人ApoA1多克隆抗体用于ApoA1检测试剂盒提供技术参考。

关键词：载脂蛋白A1;多克隆抗体;CV13佐剂;冠心病

中图分类号： S852.4+3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2021）19-0180-03

载脂蛋白A1（Apolipoprotein A1，简称ApoA1）的监测有助于某些异常脂蛋白血症的特异性诊断。已有大量临床研究表明，ApoA1是预测冠心病（ASCVD）最有价值的指标之一^[1];同时，ApoA1也可作为其他脂代谢紊乱疾病，如糖尿病、尿毒症、肾病综合征、痛风、激素代谢紊乱等的辅助观察项目^[2-5]。ApoA1检测试剂盒是临床冠心病诊断的最有效方法之一^[6]，其中，羊抗人ApoA1多克隆抗体是该检测试剂的关键核心原料。

为了获得高效价的羊抗人ApoA1多克隆抗体，在免疫制备过程中选择合适的佐剂和免疫程序是该生产工艺的关键环节。目前免疫效果最佳的商品化佐剂是弗氏佐剂，其主要免疫程序为首次免疫采用弗氏完全佐剂，2周加强免疫采用弗氏不完全佐剂。但弗氏佐剂成本过高、毒性强、乳化工艺及粘度高^[7]，使用时不方便，不适合医药企业大规模生产时使用。笔者所在实验室前期自主研发的CV13佐剂是一种水包油包水佐剂，与弗氏佐剂油包水型佐剂相比，既保留了的免疫增强效果，同時降低毒性，注射后更容易被动物吸收。与CV13同类型ISA206佐剂由法国赛比克公司生产，广泛应用于兽用疫苗领域。本研究拟比较CV13佐剂与弗氏佐剂在羊抗人ApoA1多克隆抗体制备中的免疫效力，并以商品化的ISA206佐剂作参照，以期能获得最优的免疫佐剂和免疫程序，用于羊抗人ApoA1多克隆抗体的工业化生产。

1材料与方法

1.1主要试剂

弗氏佐剂：弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，购自Sigma公司;复乳佐剂1：CV13佐剂，由笔者所在实验室制备提供;复乳佐剂2：ISA206佐剂，购自法国赛比克公司;琼脂糖，购自南京生兴生物技术有限公司;聚乙二醇（PEG），购自国药集团化学试剂有限公司;ApoAI抗体偶联亲和层析柱，购自美国GE公司;羊抗人ApoA1特异性抗体，购自上海联迈生物工程有限公司;ApoA1蛋白标准品，购自上海联迈生物工程有限公司。

1.2人载脂蛋白A1的提取、纯化和验证

采用相关文献报道的PEG沉淀法^[8]从人血浆中提取所含的高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）和极低密度脂蛋白（VLDL）并且分离。将PEG沉淀血清后的上清（HDL）用-20 ℃预冷乙醇再次沉淀、离心，沉淀用磷酸盐缓冲液复溶后经多次透析，再采用亲和层析法，利用抗原抗体可逆性结合的原理，用ApoA1抗体偶联亲和层析柱，透析后的上清液多次过柱反应、洗脱、透析，并且用 3 000 ku的超滤管超滤到需要的浓度，从而得到ApoA1天然抗原。将纯化的蛋白样品加入SDS上样缓冲液制样，通过SDS-PAGE进行分离鉴定。然后，将SDS-PAGE结束后的胶转膜，进行Western-blot。使用羊抗人ApoA1特异性抗体，与上述的转印膜进行孵育，ECL曝光后验证提取的蛋白大小。

1.3佐剂与抗原乳化

弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂分别与ApoA1蛋白1 ∶1混合，高剪切力搅拌乳化，制备油包水型免疫抗原。CV13佐剂和ISA206佐剂分别与ApoA1蛋白1 ∶1混合，低剪切力搅拌乳化，制备水包油包水型免疫抗原。不同疫苗中使用的ApoA1抗原量一致。

1.4佐剂乳化后性能

将弗式完全佐剂、CV13佐剂和206佐剂分别与ApoA1蛋白乳化后，乳液滴于冷水表面，根据扩散情况，判定剂型。

1.5动物免疫程序

成年健康湖羊20只，于2019年8月购自徐州市苏羊羊业有限公司，体质量35 kg左右，打上耳标标记，随机分为4组，每组5只。使用上一步中用不同佐剂制备的疫苗分别于0、7、14、21、28、35、42、49 d 进行免疫，具体分组见表1。免疫后定期采集湖羊的免后血清。本动物试验在江苏省农业科学院试验动物伦理委员会指导下，在江苏省农业科学院试验动物房开展。试验结束后，所有试验动物按照法律法规进行无害化处理。

1.6琼脂扩散试验检测抗体效价

在100 mL 8%氯化钠溶液中加入1.0 g优质琼脂糖，加热融化后，加入终浓度为0.01%硫柳汞防腐，浇制凝胶板（约3 mm厚）。按六角形打孔，孔径为5.0 mm、孔距为3.0 mm。将血清用生理盐水进行2倍系列稀释。中央孔加入ApoA1抗原，周围孔分别依次加入各稀释度采集的湖羊血清。加样后置于35～37 ℃湿盒中孵育，出现特异条带判定为阳性，出现条带的最大稀释倍数即为抗体效价。

1.7多克隆抗体的特异性检测

将不同的浓度的ApoA1蛋白标准品与SDS上样缓冲液配合制样，SDS-PAGE后Western-bolt转印到膜上。使用本研究制备的羊抗人ApoA1多克隆抗体进行孵育，最后ECL曝光检测制备抗体的特异性。

2结果与分析

2.1人载脂蛋白A1提取物的检验

对本研究中方法提取的ApoA1天然抗原进行检测。SDS-PAGE结果显示，提取纯化的蛋白条带单一，大小约28 ku，与目标蛋白ApoA1大小一致（图1-A）。Western-blot通过ApoA1特异性抗体检测本试验提取物为ApoA1（图1-B）。

2.2佐剂乳化性状

弗氏完全佐剂与ApoA1抗原乳化后，乳液滴于冷水表面，液滴呈圆点状浮于水表面，可判定为油包水剂型（图2-A）;CV13佐剂和206佐剂分别与ApoA1抗原乳化后，乳液滴于冷水表面，液滴呈云雾状扩散，可判定为水包油包水剂型（图2-B、C）。

2.3琼脂扩散试验检测抗体效价

采集免疫后羊血清，选择不同浓度稀释后进行琼脂扩散试验，结果显示，制备的羊抗人ApoA1抗体对ApoA1抗原呈阳性反应（图3）。

2.4不同佐剂和免疫程序抗体效价对比

从图4可见，2、4、6免后，A组血清的琼扩效价最高，达到1 ∶24;B组血清抗体效价次之，达到1 ∶23.8;C组、D组免后的羊血清抗体效价最低。8免后，A组、B组的血清抗体效价明显高于C组、D组。

2.5抗体的特异性检测

Western-blot结果显示，制备的羊抗人ApoA1多克隆抗体可以特异性结合ApoA1标准品蛋白，抗体结合量依赖ApoA1标准品蛋白的浓度增加（图5）。

3讨论

ApoA1是ApoA族中占比最多的一种组分。ApoA1为单一多肽链，由243个氨基酸残基组成，分子量为28.3 ku，是高密度脂蛋白（HDL）的主要载脂蛋白。HDL具有防止动脉粥样硬化的作用，因此，测定血清（浆）中ApoA1的含量已成为防止心脑血管疾病的常规检测项目^[9-10]。羊抗人ApoA1多克隆抗体是该检测试剂的关键核心原料，目前80%依赖进口，核心问题是缺乏产业化的人ApoA1的规模化、快速提取工艺和高活性、高纯度的多克隆抗体制备工艺技术^[11-12]。此外，前期的研究表明，佐剂的选择是影响多克隆抗体的产量和抗体效价的关键技术，因此如何提高免疫效果，提高产品质量也是目前需要解决的关键问题。

笔者所在团队专门从事疫苗佐剂研究，对复乳佐剂及其他佐剂进行了大量研究，已获得了一个复乳佐剂CV13佐剂。该配方以矿物油为基础油相，加入适宜的表面活性剂和助溶剂，使佐剂能与水相快速乳化，形成W/O/W型佐剂。该佐剂可一步乳化，工艺简单，适合工业生产使用。制备的疫苗粒径比较均一，大小在100～200 nm，更易被机体抗原提呈，激活宿主免疫系统。前期已通过多次动物试验检验，均有良好的安全性和免疫效果^[13]。CV13佐剂与弗氏佐剂比较，由于W/O/W剂型比O/W剂型容易吸收，更加安全，成本也相对便宜。本研究中，制备羊抗人ApoA1多克隆抗体时可选择首次免疫使用弗氏完全佐剂，2～8加强免疫使用CV13佐剂的免疫程序，抗体效价略高于弗氏佐剂组，但鉴于CV13价格低、乳化工艺简便和弱毒性的特点，较弗氏佐剂存在较大优势，从而可降低总生产成本，值得在企业生产中推广。该工艺技术可为我国医药企业自主制备高质量的羊抗人ApoA1多克隆抗体，生产廉价、稳定的ApoA1检测试剂盒提供技术支撑;同时减少羊抗人ApoA1多克隆抗体的进口依赖，降低我国该领域被国外“卡脖子”的潜在风险。

参考文献：

[1]姜伟超，张德太，张科，等. 糖尿病及急性冠状动脉综合征患者ApoB与ApoA1比值测定的临床意义[J]. 临床血液学杂志（输血与检验版），2013，26（12）：837-840.

[2]陈保生.载脂蛋白的结构和功能与病毒病的预防和治疗[J]. 中国医学科学院学报，2007，29（3）：448-451.

[3]刘晓辉，吴鹤，孙玉兰.急性心肌梗死早期的血脂分析[J]. 中国医师进修杂志，2006（10）：52-53.

[4]Martin I，Dubois M C，Saermark T，et al. Apolipoprotein A-1 interacts with the N-terminal fusogenic domains of SIV （simian immunodeficiency

virus） GP32 and HIV （human immunodeficiency virus） GP41：implications in viral entry[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，1992，186（1）：95-101.

[5]Panin L E，Kostina N E，Poteriaeva O N，et al.Immunochemical homology of HIV-1 envelope proteins and human apolipoprotein AI[J]. Voprosy Virusologii，2001，46（5）：13-16.

[6]胡國芳，陈保生，杨晓慧，等. 血浆载脂蛋白A-Ⅰ生理功能的研究：A-Ⅰ及其裂解片段对单纯疱疹病毒感染细胞的作用[J]. 中国医学科学院学报，1994，16（2）：98-103.

[7]高泽乾，孙建男，武炜，等. 兽用免疫佐剂的研究进展[J]. 唐山师范学院学报，2012，34（2）：45-48，51.

[8]王晶，白丽，郭利军，等. 一种制备兔抗人IGG抗体的简易方法[J]. 大理医学院学报，1999（1）：60，63.

[9]徐志伟，徐一然，陈永霞，等. 优化ApoB抗原免疫剂量提高抗体产生的效果[J]. 农学学报，2018，8（11）：58-61.

[10]Owens B J，Anantharamaiah G M，Kahlon J B，et al. Apolipoprotein A-Ⅰ and its amphipathic helix peptide analogues inhibit human immunodeficiency virus-induced syncytium formation[J]. Journal of Clinical Investigation，1990，86（4）：1142-1150.

[11]邵长玲，孔军伶.制备免疫血清免疫法改良和效果[J]. 卫生职业教育，2011，29（9）：111-112.

[12]徐志伟，刘泉，时小艳，等. 利用湖羊生产人ApoB多抗血清免疫新方法[J]. 江苏农业科学，2015，43（3）：186-187.

[13]Xu H，Niu Y L，Hong W M，et al.Development of a water-in-oil-in-water adjuvant for foot-and-mouth disease vaccine based on ginseng stem-leaf saponins as an immune booster[J]. Comparative Immunology，Microbiology and Infectious Diseases，2020，71：101499.

基金项目：江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（20）2009];江苏省镇江市科技计划（编号：SH2020001）。

作者简介：邓碧华（1981—），男，江苏无锡人，硕士，副研究员，主要从事疫苗佐剂研究。E-mail：dengbihua2000@163.com。

通信作者：徐志伟，副研究员，主要从事畜禽高效养殖等研究。E-mail：xzw1729@sina.com。