一种高通量鉴定甘蓝型油菜耐低氮种质的方法及其应用

万何平　何冰冰　陈敬东　戢强强　曾长立

摘要：构建了一套高通量的油菜水培平台，以104份甘蓝型油菜（Brassica napus L.）种质为研究材料，采用该水培平台研究测定不同油菜品种（系）苗期在高氮（10 mmol/L）和低氮（0.6 mmol/L）供应水平下的生长情况，并对104份甘蓝型油菜品种（系）的耐低氮胁迫能力进行分级。结果显示，与高氮水平相比，低氮环境能够显著抑制甘蓝型油菜的生长，且不同基因型材料间的抑制程度存在广泛遗传变异。通过叶片数比值、地上部分长度比值和地上鲜质量比值进行聚类分析，共将104份油菜品种（系）分为低氮耐受型、低氮敏感型和中间型3个等级，其中7个低氮耐受型品种，65个低氮敏感型品种，剩下32个为中间型，为油菜低氮耐受能力的遗传改良提供了理论基础和种质资源。

关键词：甘蓝型油菜;氮高效;低氮胁迫;聚类分析

中图分类号：S634.303 文献标志码： A文章编号：1002-1302（2021）19-0078-06

氮是植物生长所必需的大量元素之一，它对植物代谢、产量和品质的形成具有重要作用。据估计，全球谷物增长的将近1/2归因于氮肥的施用[1]。农作物只能吸收约1/2的农业氮肥，土壤中残留的大量氮会导致严重的生态问题，如土壤酸化、水富营养化等[2-3]。油菜是我国重要的油料作物之一，种植面积约670万hm2/年，产菜籽油约500万t/年，约占自产植物油总量的45%以上[4-5]。与其他农作物相比，油菜生长期间需要大量投入肥料，尤其是氮肥，然而油菜的氮利用效率却很低[6-7]。甘蓝型油菜（Brassica napus L.）是3种油菜（白菜型油菜、芥菜型油菜、甘蓝型油菜）中种植范围最广的种类，是我国重要的油料作物[5]。近年来，为了适应经济发展的需求，油菜的用途已从油用为主，逐渐发展为蔬菜、观赏、饲料等多功能用途[8]。其中，依托油菜花海打造农业观光旅游正成为各大投资商关注的新热点，目前已经打造的有江西婺源、陕西汉中、江苏兴化、湖北荆门、云南罗平、重庆潼南和青海门源等15个油菜观赏基地[9-10]。随着美丽乡村建设的推进，全国各地还涌现出一大批以油菜花为主题的景观。在此大的背景下，急需筛选出适应性广、耐低氮的油菜品种（系），以降低油菜花海景观的种植成本。

目前，对于不同作物的氮高效种质的筛选研究主要包括苗期筛选和全生育期筛选。但全生育期筛由于周期长、易受到环境因子的影响，难以真正全面地反映出作物对低氮的耐受能力。因此，更多的研究是在苗期对作物进行初筛，再用全生育期加以验证[11]。近年来，关于油菜氮高效基因型种质和高效机理的研究已取得了一些研究进展[12-14]。洪娟利用土培的方法对100份油菜种质在低氮和氮正常条件下地上部干质量、叶片数、叶片叶绿素含量、含氮量和氮累积量进行考察，初步筛选出氮高效和氮低效油菜种质各3份，认为生物量积累和氮素积累量是评价油菜苗期氮高效的可靠指标，叶片数可作为参考指标[15]。顾炽明等利用营养液培养的方法考察了162份油菜种质在低氮和氮正常条件下的生物量、主根长、侧根长、根冠比、氮累积量及氮吸收和利用效率，初步将162份油菜种质按氮效率分成了3类，其中双高效型23份、双低效型28份、中间型111份，同样认为生物量积累是评价油菜苗期氮高效的可靠指标[16]。究其原因，生物量积累是油菜生长发育最终结果的体现，能综合反映出植株在低氮环境下的生长情况[12]。

目前，筛选鉴定油菜氮高效的栽培方式主要为水培和土培，其中水培技术由于其能够精准控制营养成分的含量，已被成功应用于油菜肥料利用效率的研究上[14，17]。但是，目前的油菜水培技术还存在规模小、通量低、控制成本高等不足，无法满足对大规模油菜种质资源的筛选鉴定要求。为此，本研究建立了一套高通量的油菜水培系統，利用该平台对104份甘蓝型油菜种质进行耐低氮能力的筛选鉴定，在此基础上筛选获得耐低氮的油菜品种（系），为油菜氮高效遗传改良提供了理论基础和种质资源。

1材料与方法

1.1试验材料

本试验供试材料包括104份甘蓝型油菜核心种质，由中国农业科学院油料作物研究所伍晓明研究员提供，主要来自我国各油菜主产区的地方品种（系）、育种材料和栽培品种（系），油菜种质适应性强，具有广泛的遗传多样性。

1.2试验设计及表型鉴定

为了尽可能减少栽培环境对试验结果的影响，本试验建立了一套同时可容纳超过3 000株油菜幼苗的精准化控制水培系统（培养池的长、宽、高分别为12.5、0.8、0.4 m），主要包括营养液补充系统、营养液循环系统、空气泵和补光系统等（图1），并利用该系统对104份甘蓝型油菜进行种植。本试验于江汉大学湖北省汉江流域生物资源与利用工程中心的油菜水培实验室内进行。

甘蓝型油菜水培法的具体步骤如下。

（1）播种。用干净的尼龙绳将长、宽、高分别为60、40、12 cm的蓝色盆子分成60格，并在最上面铺上1层无菌纱布。向苗床内加满纯水保证纱布浸湿，将104份甘蓝型油菜材料均匀播撒到对应的小格中并记下编号，每个材料播种约50粒。

（2）制作培养板。将2 cm的高密度泡沫板制成60 cm×100 cm规格的培养板，培养板上用打孔器均匀打出140个直径约为2 cm的圆形小孔。将厚度约为2 cm的海绵剪成边长约为2.5 cm的方块，并将海绵方块沿1条对角线剪开1个小口用来固定幼苗。

（3）移苗和营养管理。配制经改良的适合甘蓝型油菜水培的营养液[18]。播种7 d后将甘蓝型油菜幼苗从纱布上取出，用海绵方块夹住下胚轴基部，然后移植至培养板上的小孔中并贴上标签，每个材料取48株生长一致的幼苗，分别移栽至6个培养板中，每个培养板移栽8株，其中高氮处理3板、低氮处理3板。最后将固定有幼苗的培养板放置在2个装有1/4全营养液的培养池（营养液总体积为 1 000 L）中进行培养。1周后更换1/2全营养液，再过1周后更换全营养液。

（4）不同氮浓度胁迫处理。幼苗移栽21 d后进行不同氮水平处理，设置高氮（10 mmol/L）和低氮（0.6 mmol/L）2个处理，具体营养液浓度见表1。

（5）表型考察与数据分析。不同氮处理21 d后测定甘蓝型油菜苗的叶片数（NL）、地上长度（SL）、地上部分鲜质量（SFW）。为了消除不同甘蓝型油菜的基因型背景差异，计算3个性状的低氮耐受指数（LNT-NL、 LNT-SL和LNT-SFW，其为低氮条件下的性状值与对照条件下性状值的比值[14，19]）。所有数据用SPSS 22.0进行分析处理，图片使用Origin 8.0和R软件制作。

2结果与分析

2.1不同氮水平条件下甘蓝型油菜品种（系）表型分析

如表2所示，在低氮处理条件下，甘蓝型油菜幼苗的NL的平均值为4.93张，变化范围为3.20～975张，变异系数为18.78%;SL的平均值为 1598 cm，变化范围为10.38～22.30 cm，变异系数为14.21%;SFW的平均值为4.26 g，变化范围为179～12.47 g，变异系数为29.98%。在高氮条件下，甘蓝型油菜幼苗的NL的平均值为6.94张，变化范围为5.00～12.33张，变异系数为16.51%;SL的平均值为21.94 cm，变化范围为14.46～27.53 cm，变异系数为14.48%;SFW的平均值为 10.91 g，变化范围为5.61～26.65 g，变异系数为30.36%;各性状在低氮环境下的表型值均极显著低于高氮环境下的表型值。在2种氮营养水平下，NL、SL和SFW都呈现连续性分布（图2），说明这些性状都符合数量性状特征。

3個低氮胁迫耐受指数（LNT-NL、LNT-SL和LNT-SFW）呈现出较大的遗传变异，LNT-NL的平均值为0.71，变化范围为0.55～0.93，变异系数为11.01%;LNT-SL的平均值为0.73，变化范围为061～0.89，变异系数为9.43%;LNT-SFW的平均值为0.41，变化范围为0.21～0.73，变异系数为31.57%。结果表明，低氮胁迫环境对不同甘蓝型油菜品种叶片数、地上长度和地上鲜质量的抑制效果存在显著差异，其中地上鲜质量受影响最大。此外，3个耐低氮指数性状均符合连续型正态分布的特征（图2），说明油菜耐低氮性状符合数量性状的遗传特征。

2.2甘蓝型油菜品种（系）各性状间的相关性分析

如图3所示，LNT-NL与低氮叶片数、低氮地上鲜质量和LNT-SFW呈极显著正相关;LNT-SL与低氮叶片数、低氮地上长度、低氮地上鲜质量以及LNT-SFW呈显著正相关，LNT-SL与高氮地上长度呈显著负相关;LNT-SFW与低氮叶片数、LNT-NL、LNT-SL以及低氮地上鲜质量呈显著正相关性， 与高氮地上长度和高氮地上鲜质量呈显著

负相关;LNT-NL和LNT-SFW间呈显著正相关;LNT-SL和LNT-SFW间呈显著正相关，而LNT-NL和LNT-SL之间不存在相关性。

2.4甘蓝型油菜低氮胁迫耐受能力的初步分级

根据LNT-NL、LNT-SL和LNT-SFW性状对104份甘蓝型油菜进行聚类分析，结果如图4所示，104份材料被分成了三大类，其中7个材料划分为低氮耐受型品种（系）（表3），其LNT-NL≥0.8，LNT-SL≥0.68，且LNT-SFW≥0.41;65个材料被划分为低氮敏感型品种（系），这些材料的LNT-NL和LNT-SL普遍在0.7以下，且LNT-SFW普遍在0.4左右，表现为对低氮敏感。剩下32个材料则被划分为中间型材料。

3讨论与结论

作物耐低氮性状是由多基因调控的数量性状，基因与环境之间存在着明显的相互作用，易受非遗传因素的影响[20-21]。因此，选择正确的评价方法是获得准确表型的关键。目前，甘蓝型油菜耐低氮种质的筛选方法主要有田间试验法和盆栽模拟试验法[22-23]。盆栽模拟试验按生长介质的不同可分为土培试验法和水培试验法。其中，土培盆栽试验更接近实际生产，是筛选耐低氮基因型最直接、最可靠的方法，但难以进行根系形态和生理生化特性的研究[24]。

近年来，水培技术已成功地应用于养分吸收的研究[9，17，25]中。在水培试验中，营养液中各种营养素的浓度、类型和供给时间都可精确控制，营养素分布相对均匀，因此十分适合用来筛选大量的耐低氮作物遗传资源[26]。尽管如此，目前普遍采用的油菜水培系统还存在以下2点不足：第一，传统油菜水培通常采用小规格的塑料方盒作为栽培容器，不同材料间会存在营养竞争关系，因此，小规格的水培容器不利于维持养分的均匀和稳定。第二，由于油菜根系长期浸入营养液中，会影响根系的正常呼吸作用，进一步影响根系对营养离子的吸收与转运。以上问题极大地限制了油菜水培的规模和表型鉴定的精准性。为此，本研究通过不断的摸索实践，建立了可容纳3 000余株油菜幼苗的水培体系，包括营养液补充系统、营养液循环系统、空气泵和补光系统。对104份甘蓝型油菜种质进行表型鉴定，结果显示，该水培体系能满足甘蓝型油菜的正常生长，是鉴定营养吸收相关表型的理想方法。

油菜是小麦、水稻和大麦轮作的一种非常适宜的作物，对后续谷物的产量产生了积极的影响[27-29]。然而，油菜比其他作物需要更多的氮肥[7]。尽管油菜可以从土壤中吸收大量的氮，但它一直被认为是一种氮肥利用率低、单位施氮种子产量低的作物，约为谷类作物的1/2[30]。此外，油菜不同时期需氮量差别很大，其中氮素苗期占全生育期40%以上[31]。因此，苗期是油菜对氮胁迫相对敏感的时期。本研究选择对甘蓝型油菜苗期的耐低氮能力进行鉴定和评价，结果显示，低氮胁迫能显著地抑制甘蓝型油菜幼苗的生长发育，主要体现在叶片数的减少、生物量积累的受限等方面。通过计算各个性状的耐低氮指数，发现在104份不同遗传背景的甘蓝型油菜种质中，其耐低氮能力存在广泛的遗传变异。通过对3个耐低氮指数进行聚类分析，筛选得到7个低氮耐受型油菜品种（系），为进一步提升现有优质油菜品种的氮利用效率提供了遗传基础。目前，虽然关于低氮胁迫对油菜的苗期和成熟期的研究相对较多，然而对种子萌发期和开花期等生长发育关键时期的研究还十分少见。因此，后期有必要继续开展这方面的研究，筛选得到全生育期耐低氮能力强的油菜资源。

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基金项目：国家重点研发计划（编号：2016YFD0100202-25）;湖北省汉江流域特色生物资源保护开发与利用工程技术研究中心开放基金（编号：06450003）;江汉大学博士启动基金（编号：06450002）。

作者简介：万何平（1988—），男，湖北武汉人，博士，讲师，主要从事油菜遗传研究。E-mail：362057164@qq.com。

通信作者：曾长立，博士，教授，主要从事油菜种质资源鉴定与利用。E-mail：973345988@qq.com。