蛋白核小球藻对罗非鱼生长性能及沉积物氮、磷和有机质含量的影响

秦 璐，陈 曦，裘丽萍，齐延凯，孟顺龙,，陈家长,

(1.南京农业大学无锡渔业学院，江苏无锡 214081；2.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心,农业农村部长江下游渔业资源环境科学观测实验站,中国水产科学研究院内陆渔业生态环境和资源重点开放实验室，江苏无锡 214081)

我国是水产养殖大国，2019年淡水养殖总产量为3 013万t，其中罗非鱼产量达164万t，占整个淡水养殖产量的5.44%[1]。吉富罗非鱼(Oreochromisniloticus)作为被改良过的品种，其遗传性状稳定，养殖周期短，是我国目前罗非鱼养殖的主导品种之一[2，3]。当前通过添加外源物质来提高罗非鱼的生长性能，提升肉质和口感，增加鱼体的抗逆性等是重要的研究方向。

小球藻(Chlorellapyrenoidosa)属于绿藻门绿藻纲小球藻属，含有多种不饱和脂肪酸、蛋白质、类胡萝卜素、生物多糖、矿物质、微量元素和生物活性物质及代谢产物[4]。小球藻在畜禽和水产生物饲料中被广泛应用，现已发展为极具开发潜力的饲料添加物质[5]。众多研究结果表明小球藻具有调节免疫、提高抗氧化能力、改善动物生长、提高养殖效益等多方面生物功能。刘华忠等[6]研究表明饲料中添加螺旋藻可以提高彭泽鲫(Carassiusauratusvar.pengsenensis)的生长速率和成活率，降低饵料系数。宁运旺等[7]把螺旋藻添加到幼鳖饲料中，发现幼鳖增重率较对照组升高，摄食量也有不同程度增加。在奥尼罗非鱼(O.niloticus♀×O.aureus♂)养殖水体中，添加0.10%的马尾藻多糖可以显著促进鱼体生长，提高增重率，降低饲料系数[8]。

目前，针对小球藻的研究主要集中在对养殖水体净化方面的影响，而对沉积物和鱼体方面的研究还相对薄弱。相对于传统养殖模式而言，在集约化养殖过程中，饲料的投喂量较多，投入饲料中的氮磷少部分以鱼体生物量形式产出，更多未被利用的氮磷则会进入水体，从而破坏水环境，如果这一过程不能及时加以控制或改善，易造成水体富营养化[9]，进而成为农业污染源[10]；同时，污水处理设施的建设还不太成熟，无法完全跟上水产养殖业发展的节奏，一些未经处理的养殖污水直接排入到河流中，对河流生态系统造成严重破坏[11,12]。

有研究表明，自然条件下和人为输入到池塘系统的营养物质中，有50% 以上的氮、磷营养盐会富集到池塘沉积物中[13,14]。当池塘中的底泥受到扰动或水环境条件发生变化时，沉积物中的营养盐会释放到上层水体中，引起整个养殖系统环境波动，对水产养殖生物的生长造成很大影响[15-17]，沉积物的污染状况可以间接反映养殖水域环境的变化和河流受污染的程度[18]。对于污染比较严重的集约化养殖池塘，可以通过研究添加外源物质，研究池塘表层沉积物中营养盐的含量及其分布特征，探究养殖池塘及河流的污染现状[19]，因此，从沉积物层面开展池塘污染状况的研究至关重要。

鉴于小球藻对水体的净化作用以及为水产动物提供饵料的功能，本试验以吉富罗非鱼为试验对象，通过在水体中添加不同水平的小球藻，研究其通过净化水体和提供能量两方面直接和间接对罗非鱼生长性能和沉积物氮磷、有机质的影响，以期为罗非鱼高效环保配合饲料的配制提供理论依据[20]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用藻为蛋白核小球藻，购自中国科学院淡水藻种库(FACHB)，在实验室用BG11液体培养基对藻种进行扩大培养。试验用鱼宜兴罗非鱼养殖试验基地提供。

1.2 试验设计

1.2.1 试验分组和养殖周期

选取体重为(14.18±0.93) g的鱼360尾随机分为对照组(NC)、低浓度组(LC)、中浓度组(MC)和高浓度组(HC) 4个组，根据之前做的预实验及学者对小球藻净化水体的最佳浓度，确定小球藻的初始浓度为1×109cell/L，添加量为0、50、500 和5 000 mL，每10 d添加一次，根据藻浓度-吸光度之间的关系，确定每次应该加入小球藻的体积。每个处理组3个重复，每个重复放养30尾鱼，在1 000 L的圆形聚乙烯桶中进行室外养殖试验。每个桶中加水800 L自来水，用增氧泵曝气7 d以上后使用。试验期间不换水，但由于渗漏、降水和天气原因蒸发的水体，需在每次取样后补充到初始量。养殖时间为2020年7-9月，每天定时投饵两次，分别为上午9:00和下午16:00，养殖过程中投喂的饲料为罗非鱼养殖配合饲料，投喂量为养殖桶中鱼体重量的3%。用充气泵全天增氧，每天下午记录养殖水体温度、溶解氧和pH。

1.2.2 样品采集

每10 d从各养殖桶里分别随机取两尾罗非鱼，试验期间共采样6次(含试验开始时取样1次)，立即测定其全长、体长和体重。用沉积物被动采集器收集沉积物，试验开始前在养殖水体中不添加沉积物，每次取样时先把采集器从养殖桶中慢慢取出，转移至塑料桶中，静置一段时间后用虹吸管吸取上层水体，把剩余沉积物自然风干。取风干后的沉积物，在冷冻干燥机中过夜冻干，称重后在高速粉碎机中粉碎、在100目筛网中过滤后用于测定总氮、总磷和有机质。

1.3 实验方法

1.3.1 鱼体生长指标测定

用数显游标卡尺测量鱼体全长、体长，用电子秤称量体重。各指标计算方法如下：

存活率=100%×Nt/N0;

增重率(WGR)=100%×(Wt-W0)/W0;

特定生长率(SGR)=100%×(lnWt-lnW0)/t;

体重绝对增长率(AGRW,g/d)=(Wt-W0+Wd)/t,

其中，Wt(g)为试验末全鱼总重，W0(g)为试验初始全鱼总重，t(d)为试验的天数，Nt和N0分别为试验末和试验初鱼体数量，Wd(g)为试验末死亡鱼体总的重量，W(g)为体重。

1.3.2 沉积物中总氮、总磷和有机质含量的测定

沉积物中总氮用凯氏定氮仪法测定，沉积物总磷用高氯酸-硫酸消化法测定，沉积物有机质含量使用重铬酸钾法测定。

1.3.3 有机污染指数评价

有机污染指数法通常被用来评价湖库沉积物的营养状况，而有机氮则是判断沉积物受氮污染程度的重要指标，见表1。

表1 沉积物有机污染指数评价标准Tab.1 Evaluation criteria of organic pollution index in the sediments

评价标准与计算方法:

有机污染指数(OI)=有机碳(OC)% ×有机氮(ON)% (1)；

有机碳(OC)%=有机质(OM)%/1.724 (2)；

有机氮(ON)%=总氮(TN)% × 95% (3)。

2 结果与分析

2.1 鱼体生长指标

2.1.1 鱼体体重相关指标的变化

由图1可知，不同处理组鱼体的终末体质量都有不同程度的增加，其中HC和NC、LC相比差异显著，而HC和MC之间没有显著性差异。对养殖试验期间鱼体的WGR比较分析，发现其变化规律和终末体质量相似，不同的是MC和HC之间也有显著差异。

图1 不同取样时期鱼体体重变化Fig.1 Changes of body weight in different sampling periods

分析发现MC、LC和NC相比没有显著性差异，但HC和NC相比差异显著。养殖试验期间，鱼体AGRW和不同处理之间的SGR差异性相同，只有HC与NC之间差异显著，养殖试验期间，鱼体没出现异常死亡情况(表2)。

表2 不同浓度小球藻对吉富罗非鱼生长性能的影响Tab.2 Effects of different concentrations of C.Pyrenoidosa on the growth performance of O.niloticus

2.1.2 鱼体全长、体长的变化

图2为不同取样时间下各处理组之间鱼体全长和体长的变化。从图中可以看出，随取样次数的增加，各处理组鱼体全长和体长都呈增加趋势。NC和LC两条折线相差不大，末次取样和初次取样时的全长差别不明显。和NC相比，MC和HC两条折线始终在其上方，对鱼体体长的影响与对照组相比差异显著。从图中可以看出，鱼体体长随取样次数的增加呈整体上升趋势，其中MC和HC上升的更快。在第二次和第四次取样时，MC和HC的体长和NC相比差异显著，在前三次取样时，MC的体长高于HC，但后两次取样时，HC的值高于MC的值。

图2 不同取样时期鱼体全长、体长变化Fig.2 Changes of body length and body length in different sampling periods

2.2 添加小球藻对沉积物的影响

2.2.1 添加小球藻对沉积物产生量的影响

图3为养殖期间各处理组养殖桶中沉积物的产生总量图。从图中可以看出，试验期间沉积物的产生总量为：HC>MC>LC>NC。NC与其它三个处理组差别较大，但三个处理组之间差异较小。

图3 不同处理组沉积物产生总量Fig.3 Total amount of sediment produced by different treatment groups

2.2.2 添加小球藻对沉积物TN的影响

不同处理组沉积物中TN的含量如图4。随着取样次数的增加，罗非鱼养殖过程中沉积物TN的含量整体呈上升趋势。从单个取样时间点来看，在第二次和第三次取样时，HC沉积物TN含量和NC差异显著；在第一次取样时，各处理组之间TN含量差异不大，MC的TN含量略高于其它三个处理组；第三次取样时，HC与其它三个组差异均显著，但三个处理组之间差异不大；第四次和第五次取样各处理组之间均不存在显著性差异。

图4 不同处理组沉积物TN含量Fig.4 Total nitrogen content in sediments of different treatment groups

2.2.3 添加小球藻对沉积物TP的影响

从图5中可以看出，在整个罗非鱼养殖试验过程中，沉积物总磷的含量呈先升高后降低的趋势。从单一时间节点来看，在第一次取样时，各组TP含量均处于较低水平，NC、LC和MC均与HC有显著性差异。第三、四和五次取样时，NC沉积物TP的含量变化不大，但LC、HC与NC相比差异显著，第三次取样时，NC与HC也有显著性差异，其它各处理组之间差异不明显。

图5 不同处理组沉积物TP含量Fig.5 Total phosphorus content in sediments of different treatment groups

2.2.4 添加小球藻对沉积物OM的影响

图6为不同取样时期，不同处理组沉积物中OM的含量分析柱状图。从图中可以看出，从第一次取样到最后一次取样，沉积物中OM含量一直处于较高水平。从单个时间节点来看，第一次取样时，HC与其它三个处理组均有显著性差异，但这三个组之间没有显著性差异；第二、三次取样时，对沉积物OM分析发现，NC与HC之间有显著性差异；第四次和第五次取样时，各处理组之间差异不显著，但LC、MC、HC三个处理组OM含量比NC低，在其它各次取样时也能得出相同结论。

图6 不同处理沉积物OM含量Fig.6 The organic matter in sediments of different treatment groups

2.2.5 沉积物中TN、TP、OM的相关性分析

表3为罗非鱼养殖试验期间TN、TP和OM之间的Pearson相关性分析表。从表中可以看出，沉积物TN和TP的相关性系数为0.298，具有显著正相关性，而沉积物TN和OM、TP和OM之间相关性不显著。

表3 沉积物TN、TP和OM的Pearson相关性Tab.3 Pearson correlation of TN,TP and OM in sediments

2.2.6 沉积物污染状况评价

采用OI对不同浓度小球藻添加组进行沉积物营养盐状况评价，其结果见图7。

图7 不同添加组沉积物OIFig.7 Contents of organic matter in sediments of different additive groups

不同取样次数各处理组沉积物的OI如图7所示。从图中可以看出，整个养殖过程中OI值小于0.05，为II级清洁型底质。NC的OI在养殖过程中呈上升趋势，在第五次取样时又降低。从单个取样时间点来看，在前两次取样时，三个处理组的OI高于对照组；第三次取样时，OI值NC>LC>MC>HC，但各处理组之间差异不显著；第四次取样时，各组之间的OI值基本持平，MC的值相对较低；最后一次取样时，MC和LC的值高于NC，HC的数值低于NC，但各组之间的差异性未达到显著性水平。

3 讨论

本实验结果显示，随着小球藻水平的增加，吉富罗非鱼的增重率、特定生长率均呈增加趋势，高浓度添加组吉富罗非鱼的生长性能最佳，饲料利用率最高。苗卫卫等[10]研究发现，添加蛋白核小球藻和种植空心菜均能增加南美白对虾(Litopenaeusvannamei)特定生长率和成活率，这与本研究的结论类似，分析原因可能与小球藻中含有丰富的氨基酸以及鱼体生长必需的脂肪酸有关，也与小球藻中含有促生长因子(CGF)能够满足罗非鱼的生长需要[22]有关。同时，本试验发现，高浓度添加水平与中等浓度添加水平对鱼体增重率和特定增长率影响差异不显著，说明中浓度的小球藻已经可以对鱼体生长产生较理想的促进效果。林钦等[22]的研究结果表明，随着小球藻添加的增加，黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)的终末体重、增重率呈上升趋势，并随着养殖的进行，变化幅度增大，这可能与养殖鱼类以及养殖环境的变化有重要的关系，与本研究结果一致。随着处理时间的增加，鱼体的增重率和特定生长率呈上升趋势，出现此结果的原因可能与小球藻内丰富的生物活性物质有关，其内特殊的生长因子 CGF 对细胞生长具有促进作用。

有学者研究发现，虎杖种植可以增加底泥总有机碳(TOC)的含量[23]，本研究结果显示，添加小球藻可以不同程度降低罗非鱼养殖水体中的TOC和OM的含量，一方面可能与试验所用的植物种类不同有关。虎杖为大型水生植物，根系较大，可以形成生物膜，促进水体中的絮凝物沉积到水底，而小球藻属于小型浮游植物，可以吸收水体中的物质供自身生长代谢；另一方面，也可能与养殖环境有关。本试验研究结果表明，高浓度小球藻添加可以显著降低罗非鱼养殖水体中的TN和TP含量，此前有研究表明虎杖种植可以显著降低底泥中 TP、TN含量[24]，黎建斌等[25]研究了氧化底改和有益活菌联合作用对池塘底泥总氮及总磷的降解作用，发现对照组的TN、TP含量显著高于处理组，本试验研究结果和其一致，这可能是因为小球藻和虎杖都可以吸收水体和沉积物中的营养盐，含有的生物活性物质可以促进鱼体的摄食，使残饵的含量减少，从而降低沉积物中的氮磷含量。

本研究中添加低浓度的小球藻对养殖过程沉积物的污染指数影响不大，但各个取样时间HC的OI显著低于对照NC，这说明小球藻可以通过调节水体，改善水环境，影响鱼类的摄食和排泄活动，从而降低了沉积物中的有机物的产生量，进而降低OI，改善底质环境。研究水质状况和沉积物理化指标之间的相关性，从而建立不同条件下的相关性模型。对于湖泊等大型水体，可以通过检测沉积物不同层度的 理化指标值来估测湖泊水体所经历的水质条件；对于养殖池塘等小水体，可以跟踪水质的变化来把握宏观的沉积物污染状况。同时，发展和完善沉积物理化指标分析技术，建立养殖池塘沉积物污染系数标准，以期改善和控制国内养殖池塘水体的污染状况。

4 结论

本研究发现，添加小球藻可以改善吉富罗非鱼的生长性能，显著提升鱼体增重率、特定生长率、体重绝对增长率和成活率。添加小球藻对鱼体的全长、体长的增加效果更明显，在养殖后期显著增加了鱼体的全长和体长。此外，小球藻的添加可以通过改善水体状况、促进鱼类的摄食，进而降低沉积物氮磷的含量。小球藻还可以显著降低罗非鱼养殖过程中有机污染指数。