枸骨叶水提物对高脂血症大鼠血脂水平及抗氧化活性的影响

张旭东，王杰宁，季旻晔，李金平

(1.上海交通大学医学院附属瑞金医院，上海 201801；2.上海市第七人民医院，上海 200137)

高脂血症由人体脂质代谢紊乱引发，是常见的疾病之一。高脂血症患者血清脂质水平显著高于正常人，该疾病已成为引起心血管疾病的主要原因之一，因此有必要寻找安全有效的治疗药物[1-2]。目前人们对天然中草药治疗疾病和改善健康状况的作用越来越感兴趣，并且已有大量研究证明其安全可靠。枸骨叶是一种天然野生冬青科植物枸骨的叶片，含有黄酮类、皂苷等多种有效物质，具有抗氧化、抑菌、降血脂功效[3]。研究表明，枸骨叶能有效降低高脂血症模型大鼠的血清血脂水平并调节血流异常情况[4]。本研究通过构建高脂血症大鼠模型，探究枸骨叶水提物(ICAE)对高脂血症大鼠血脂水平及肝脏抗氧化活性的影响。

1 仪器与材料

1.1仪器 RT2100C型全自动酶标仪(德国IFP公司)；AU5800型全自动生化分析系统(美国贝克曼库尔特有限公司)。

1.2试药 辛伐他汀(浙江京新药业股份有限公司)；总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)检测试剂盒(批号分别为：SBJ-M0602、SBJ-R0195)，均购自南京森贝伽生物科技有限公司；高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，批号分别为CD-107591-ELISA、CD-109021-ELISA，均购自武汉纯度生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)，批号分别为QYS-23028、QYS-23035，均购自齐一生物科技(上海)有限公司；谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px，批号E0101，上海宝曼生物科技有限公司)。

1.3动物 72只健康的雄性SD大鼠，体质量为155～186 g，由武汉大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(鄂)2008-0004，所有大鼠于正常明暗交替、相对湿度为40%～70%的环境中适应性饲养7 d，自由饮食。

2 方法

2.1ICAE的制备 枸骨叶购自安徽省冰源堂药业有限责任公司，经医院内中医药专家鉴定为正品。将200 g枸骨叶以料液比为1∶10的比例加入去离子水煮沸提取2次(2 h·次-1)浓缩为200 mL，即枸骨叶含量为1 g·mL-1[4]。

2.2动物分组及给药 将72只大鼠分为空白对照组与模型组，空白对照组(12只)以基础饲料喂养，模型组(60只)以高脂饲料喂养[基础饲料(790 g·kg-1)+蛋黄粉(100 g·kg-1)+猪油(100 g·kg-1)+胆固醇(10 g·kg-1)]，进行为期4周的模型建立，与造模前相比，造模后大鼠血清中TC、TG和LDL-C水平显著增加，HDL-C水平显著降低即为造模成功[5]。造模成功后将模型组大鼠分为模型对照组、阳性对照组(辛伐他汀，1.33 mg·kg-1)、ICAE低剂量组(0.15 g·mL-1)、ICAE中剂量组(0.30 g·mL-1)和ICAE高剂量组(0.60 g·mL-1)[6]。空白对照组及模型对照组以生理盐水进行灌胃，其他组以相应药物灌胃，每日1次，剂量为10 mL·kg-1，为期6周。每周称取1次体质量以调整灌胃剂量[4]。

2.3血清指标检测 于造模前、结束及药物处理后分别进行尾静脉取血(n=12)，以4 000 r·min-1离心10 min，取上清，检测TC、TG、HDL-C和LDL-C水平，并计算动脉粥样硬化指数(AI1和AI2)：AI1=(TC-HDL-C)÷HDL-C;AI2=LDL-C÷HDL-C。

2.4肝脏抗氧化指标检测 取肝脏并称质量，计算肝脏指数，肝脏指数=(肝脏质量-体质量)×100%；在研钵中将肝组织研磨成匀浆液，以 4 000 r·min-1离心10 min，取上清，再根据试剂盒说明书检测SOD、MDA和GSH-Px水平(n=5)。

2.5苏木精-伊红(HE)染色 取肝脏组织用多聚甲醛固定后乙醇脱水，用石蜡包埋后切片(4 μm)，依次用二甲苯脱蜡及梯度乙醇处理后进行HE染色、脱水、封片，并用显微镜观察(n=5)。

2.6油红O染色 取2.5项下所余肝脏组织，制作冰冻切片(7 μm)，油红染液染色30 min后异丙醇分色，用苏木精染色2 min，蒸馏水清洗至无色后甘油明胶封片，选取玻片10张1组，每张选取6个视野进行图像分析(200×)。

3 结果

3.1造模后各组大鼠血脂变化情况 与空白对照组相比，造模4周后，模型组大鼠血清中TC、TG和LDL-C水平显著增加(P<0.05)，而HDL-C水平显著降低(P<0.05)，说明造模成功。见表1。

表1 造模前、后各组大鼠血脂变化情况

3.2大鼠体质量变化情况 6周后模型对照组大鼠与空白对照组相比体质量显著增加(P<0.05)；与模型对照组相比，阳性对照组、ICAE低、中和高剂量组大鼠体质量显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 大鼠体质量变化情况

3.3ICAE对高脂血症大鼠血脂水平的影响 模型对照组大鼠与空白对照组相比，血清中TC、TG和LDL-C水平显著增加，而HDL-C水平显著降低(P<0.05)；与模型对照组相比，阳性对照组、ICAE低、中和高剂量组大鼠血清中TC、TG和LDL-C水平显著降低，而HDL-C水平显著增加(P<0.05)。见表3。

表3 ICAE对高脂血症大鼠血脂水平的影响

3.4ICAE对高脂血症大鼠动脉粥样硬化指数的影响 模型对照组大鼠与空白对照组相比，AI1和AI2显著增加(P<0.05)；与模型对照组相比，阳性对照组、ICAE低、中和高剂量组大鼠AI1和AI2显著降低(P<0.05)。见表4。

表4 ICAE对高脂血症大鼠动脉粥样硬化指数的影响

3.5ICAE对高脂血症大鼠肝脏抗氧化活性的影响 模型对照组大鼠与空白对照组相比，肝脏中MDA显著增加，SOD和GSH-Px显著降低(P<0.05)；与模型对照组相比，阳性对照组、ICAE低、中和高剂量组大鼠肝脏中MDA显著降低，SOD和GSH-Px显著增加(P<0.05)。见表5。

表5 ICAE对高脂血症大鼠血清抗氧化活性的影响

3.6ICAE对高脂血症大鼠肝脏指数的影响 模型对照组大鼠与空白对照组相比，大鼠肝脏指数显著增加(P<0.05)；与模型对照组相比，阳性对照组、ICAE低、中和高剂量组大鼠肝脏指数显著降低(P<0.05)。见表6。

表6 ICAE对高脂血症大鼠肝脏指数的影响

3.7各组大鼠肝脏组织病理学检测 空白对照组大鼠肝细胞整齐紧密，呈放射状排列，肝小叶轮廓清晰可见，无空泡变性现象；模型对照组肝组织细胞内出现脂肪空泡现象，变性严重，细胞排列紊乱，肝小叶界限模糊不清，炎性细胞浸润现象严重；阳性对照组及ICAE低、中和高剂量组随着药物剂量的增加细胞排列逐渐整齐，脂肪空泡及炎性细胞浸润现象减轻，肝小叶结构逐渐清晰。见图1。

图1 肝脏组织病理学观察 (HE，200×)

3.8各组肝脏油红O染色结果比较 空白对照组肝组织形态结构正常，模型对照组肝组织中出现橘红色脂质沉积现象，而阳性对照组及ICAE低、中、高剂量组随着药物剂量的增加橘红色脂质沉积逐渐减少。见图2。

图2 肝脏油红O染色结果比较 (200×)

4 讨论

高脂血症已被证明是动脉粥样硬化及引发心血管疾病的重要危险因素之一，具体表现为LDL-C、HDL-C等水平失衡[7-9]。高脂血症还包括TC和TG水平均升高的高三酰甘油血症及混合性高脂血症[10]。已有研究表明，LDL-C水平升高可导致动脉内斑块积聚，从而增加心肌梗死、中风等心血管疾病的发生风险，而HDL-C可清除体内胆固醇，其水平升高可降低动脉粥样硬化性心血管疾病的风险[11]。目前治疗高脂血症的他汀类药物治疗效果差且会产生不良反应，因此有必要寻找更加安全有效的治疗药物。目前已有大量研究证明，中药治疗疾病和改善健康状况的安全性高。研究表明，新疆芹菜根可降低高脂血症大鼠血清中TC和TG水平，升高HDL-C和SOD水平，减轻肝脏脂肪变性程度，表现出有效的降血脂和抗氧化作用[12]。还有研究表明，复方四味余甘子方通过降低肝脏三羟基三甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)阳性细胞数量及血清TG、TC、LDL-C和MDA含量起到降血脂和抑制脂质过氧化反应的作用[13]。此外，有研究表明，在高脂血症大鼠中丹红的降血脂功能及促进脂肪酸氧化的作用与激活腺苷酸激活蛋白激酶/胆固醇调节元件结合蛋白/乙酰辅酶A羧化酶(AMPK/SREBP-1/ACC)通路有关[14]。

枸骨叶是一种天然野生中药，具有抗炎、抑菌、降血压、降血脂、抗脂肪肝和提高抗氧化能力的功效，研究表明，其能有效降低高脂血症大鼠血清血脂水平并调节血流异常情况[4,15-16]。ICAE能通过降低高脂饮食(HFD)小鼠体质量、肝质量、皮下脂肪含量、TC和TG水平达到预防肥胖的目的，并且可通过抑制脂肪分化关键转录因子(PPARγ)的表达来抑制脂肪分化[15]。另有研究表明，ICAE通过降低磷酸化表皮生长因子受体(p-EGFR)在肝脏中的表达水平来降低高脂饮食小鼠的血脂水平[17]。本研究发现，高脂血症模型对照组大鼠与空白对照组相比体质量、TC、TG、LDL-C、AI1和AI2显著增加，而HDL-C显著降低；与模型对照组相比，阳性对照组及ICAE低、中、高剂量组大鼠体质量、TC、TG、LDL-C、AI1和AI2显著降低，而HDL-C显著增加，与其他研究结果一致，这表明ICAE具有有效降低体质量、降血脂和降低动脉粥样硬化患病风险的功效。

机体内活性氧自由基(ROS)的产生与清除处于动态平衡状态，疾病的产生可导致这一平衡失调，从而对机体造成损伤，抗氧化系统在这一过程中起重要作用[1]。MDA作为脂质过氧化产物可反映机体脂质过氧化程度[18-19]。SOD和GSH-Px是细胞酶系统中重要的抗氧化剂，SOD能有效清除体内ROS以降低氧化损伤，而GSH-Px可抑制多不饱和脂肪酸的过氧化，因此两者在机体内具有重要的抗氧化作用[18,20-21]。相关研究表明，枸骨叶提取物能够通过降低血清MDA含量、增加SOD活性来提高高脂血症大鼠的抗氧化能力[4]。本研究发现，模型对照组大鼠与空白对照组相比，肝脏中MDA显著增加，而SOD和GSH-Px显著降低；与模型对照组相比，阳性对照组及ICAE高、中、低剂量组大鼠MDA显著降低，而SOD和GSH-Px显著增加。该结果表明，ICAE能通过增加SOD和GSH-Px水平、降低MDA水平提高高脂血症大鼠肝脏的抗氧化能力。

此外，研究还发现，模型对照组大鼠与空白对照组相比，肝脏指数显著增加、肝脏脂肪病变程度加深及脂肪沉积严重，而阳性对照组及ICAE低、中和高剂量组大鼠肝脏指数、肝脏脂肪病变程度及脂肪沉积现象与模型对照组比较明显减轻，这表明ICAE能通过降血脂作用有效降低高脂血症大鼠脂肪肝的形成。

综上所述，ICAE可有效降低高脂血症大鼠血脂水平，并提高大鼠肝脏抗氧化能力，预防脂肪肝的形成。本研究在已有研究的基础上进一步研究ICAE对高脂血症大鼠肝脏抗氧化能力的影响，为ICAE治疗高脂血症提供充足的理论依据，但关于ICAE治疗高脂血症的最佳剂量还需进一步探索。