三阴性乳腺癌与非三阴性乳腺癌组织中PD-1、PD-L1、FOXP3 的差异表达及其临床意义

贾秀鹏，蒙伶俐，李海莉，陈 洁，陈佳意

（宁波市临床病理诊断中心，浙江 宁波 315000）

乳腺癌（breast cancer）是一种常见的恶性肿瘤[1-3]，是全球妇女癌症相关死亡的第一大原因。目前，对于乳腺癌的发病机制仍知之甚少，主要是恶性肿瘤侵犯破坏乳腺正常组织并通过淋巴管、血道，引起局部或全身复发转移。临床常用的乳腺癌治疗方法包括化学治疗、内分泌治疗、曲妥珠单抗靶向治疗、免疫治疗及放射治疗等。三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是目前被公认的临床治疗效果最差，争议最多的一种亚型[4]。程序性死亡分子-1（programmed death-1，PD-1）、程序性死亡分子配体-1（programmed death ligand-1，PD-L1）均为肿瘤免疫检查点，在人类免疫调节途径中起着重要作用[2]。研究表明[3]，PD-1/ PD-L1 在肿瘤组织中可通过传递抑制性信号，引起肿瘤特异性T 细胞无法活化，从而不能将肿瘤细胞杀死，最终可导致抗肿瘤免疫降低甚至失效。叉状头/翅膀状螺旋转录因子（forkhead/winged helix transcription factor，FOXP3）被认为是调节性T 细胞独立的标记物，可通过诱导体内调节性T 淋巴细胞发挥负性调节功能，最终诱导癌细胞的免疫逃逸[4]。目前，PD-1、PD-L1、FOXP3 已被报道在食管鳞状细胞癌[5]、非小细胞肺癌[6]、肝癌、结肠癌等多种恶性肿瘤组织中存在高水平表达，并被证实与患者临床病理特征密切相关，然而，其在乳腺癌中报道尚不多见，尤其在三阴性乳腺癌的相关研究者报道甚少。本研究通过测定70例三阴性乳腺癌，30例非三阴性乳腺癌患者组织中PD-1、PD-L1、调节性T 淋巴细胞FOXP3的表达情况，探讨其与三阴性乳腺癌患者临床病理特征间的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015 年1 月-2020 年1 月经宁波市临床病理诊断中心诊断的70例三阴性乳腺癌，30例非三阴性乳腺癌患者为研究对象。100例乳腺癌患者中组织学分级Ⅰ、Ⅱ级者35例、Ⅲ级者65例；淋巴血管侵犯者38例，有淋巴结转移者31例。本研究经中心伦理委员会批准，取得患者知情同意并签署同意书。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准 ①年龄18～65岁；②经手术切除治疗；③术前未接受过放疗、化疗；④临床资料完整。

1.2.2 排除标准 ①合并其他恶性肿瘤；②合并免疫系统疾病。

1.3 方法 采用免疫组化法测定组织中PD-1、PDL1、FOXP3 的表达。组织制成厚度为4 μm 的连续切片，经常规脱蜡至水，所有免疫组化均在Leica BOND-MAX 全自动免疫组织化学仪上操作。DAB显色，以苏木精轻度复染；分别以已知阳性扁桃体组织作为阳性对照、PBS 代替一抗作为阴性对照；其中鼠抗人PD-1、鼠抗人FOXP3、兔抗人CD3 单克隆抗体试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，兔抗人PD-L1 多克隆抗体（克隆号SP142）购自英国Abcam 公司。免疫组织化学结果均由2名高年资乳腺病理专科医师进行双盲独立阅片。ER/PR 判断标准依据2020 年美国临床肿瘤学会/美国病理医师学院（ASCO/CAP）判断标准[7]，ER 和PR 胞核阳性细胞≥1%判定为阳性。HER2 判读标准依据2019 年中国乳腺癌HER2 检测指南[8]，0～1＋表示阴性，3＋表示阳性，2＋则进行荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）检测，如HER2 基因无扩增则为阴性。PD-L1 以细胞膜和/或细胞质出现棕黄至棕褐色为阳性。PD-L1 以阳性细胞数≥1%判为阳性，＜1%判为阴性[9]，分别评价肿瘤细胞及间质肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）中PD-L1的表达情况。PD-1 表达于间质TIL，以细胞核出现棕黄至棕褐色为阳性。以阳性细胞数≥5%判为阳性，＜5%判为阴性[9]，FOXP3 阳性判定标准：FOXP3阳性物为黄色或棕黄色颗粒，定位于调节性T 细胞的细胞核内[10]。

1.4 观察指标 ①比较三阴性乳腺癌组织与非三阴性乳腺癌组织中PD-1、PD-L1、FOXP3 阳性表达情况；②比较不同年龄、肿瘤直径、组织分化程度、淋巴血管侵犯情况、淋巴结转移情况患者乳腺癌组织中肿瘤细胞及间质肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）PD-1、PD-L1、调节性T 淋巴细胞FOXP3 阳性表达率。

1.5 统计学处理 本研究数据采用SPSS 20.0 统计分析软件处理，计数资料以（%）表示，比较采用χ2分析；P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PD-1、PD-L1、FOXP3 表达情况比较 三阴性乳腺癌组织中肿瘤细胞及间质肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）中PD-1、PD-L1、调节性T 淋巴细胞FOXP3阳性表达率均高于非三阴性乳腺癌组织，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1、图1。

图1 免疫组化法测定PD-1、PD-L1、FOXP3 蛋白表达（×400）

表1 三阴性乳腺癌组织与非三阴性乳腺癌组织中PD-1、PD-L1、FOXP3 阳性率比较[n（%）]

2.2 三阴性乳腺癌组织中间质TIL PD-1 阳性表达率与患者临床病理特征的关系 三阴性乳腺癌组织中间质TILPD-1 阳性表达率与患者年龄、肿瘤直径比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；组织学分级为Ⅲ级、淋巴血管侵犯及淋巴结转移患者三阴性乳腺癌组织中间质TILPD-1 阳性表达率分别高于组织学分级为Ⅰ、Ⅱ级、无淋巴血管侵犯及无淋巴结转移患者，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 三阴性乳腺癌组织中间质TILPD-1 阳性表达率与患者临床病理特征的关系[n（%）]

2.3 三阴性乳腺癌组织中PD-L1 阳性表达率与患者临床病理特征的关系 三阴性乳腺癌组织中肿瘤细胞及间质TIL 中PD-L1 阳性表达率与患者年龄、肿瘤直径比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；组织学分级为Ⅲ级、淋巴血管侵犯及淋巴结转移患者三阴性乳腺癌组织肿瘤细胞及间质TIL 中PD-L1阳性表达率分别高于组织学分级为Ⅰ、Ⅱ级、无淋巴血管间隙侵犯及无淋巴结转移患者，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 三阴性乳腺癌组织中PD-L1 阳性表达率与患者临床病理特征的关系[n（%）]

2.4 三阴性乳腺癌组织中调节性T 细胞FOXP3 阳性表达率与患者临床病理特征的关系 三阴性乳腺癌组织中调节性T 细胞FOXP3 阳性表达率与患者年龄、肿瘤直径及有无淋巴结转移比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；组织学分级为Ⅲ级、淋巴血管侵犯患者三阴性乳腺癌组织中调节性T 细胞FOXP3 阳性表达率分别高于组织学分级为Ⅰ、Ⅱ级、无淋巴血管侵犯患者，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 三阴性乳腺癌组织中FOXP3 阳性表达率与患者临床病理特征的关系[n（%）]

3 讨论

PD-L1 又称为B7 同源体1（B7 homolog 1，B7-H1），是通过人类基因库进行B7-1、B7-2 同源性分析时发现的。人PD-L1 基因定位于染色体9p24.2，cDNA 全长873bp[10，11]。PD-L1 mRNA 在许多组织中可以检测到，在心脏、胎盘、肺脏和骨骼肌表达较高，在胸腺、肝脏、脾脏和肾脏呈低水平表达。免疫组织化学法研究表明PD-L1 蛋白的表达在正常组织中仅局限于巨噬系统来源的细胞，如肝脏的Kupffer 细胞，肺脏的巨噬细胞，扁桃体副皮质区的组织细胞等。而在人类肺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、恶性脑肿瘤、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、肾细胞癌等许多肿瘤组织中都可检测到PD-L1 的表达。有些不表达PD-L1的肿瘤细胞在IFN-γ 刺激后可诱导其表达。PD-1是PD-L1 的受体[12-14]。PD-1、PD-L1 均为肿瘤免疫检查点，在人类免疫调节途径中起着重要作用[2]。研究表明[3]，PD-1/PD-L1 在肿瘤组织中可通过传递抑制性信号，引起肿瘤特异性T 细胞无法活化，从而不能将肿瘤细胞杀死，最终可导致抗肿瘤免疫降低甚至失效。

PD-L1 在多种实体肿瘤组织中的异常高表达近年来引起广泛的关注，并且在结肠癌、肾细胞癌、宫颈癌中的高表达与肿瘤的不良预后有关。隋启海等[5]以食管鳞状细胞癌患者为研究对象，发现癌组织与癌旁组织中PD-1、PD-L1 表达水平存在显著差异，且PD-1、PD-L1 水平与肿瘤T分期相关；吴菡等[6]研究发现，非小细胞肺癌患者PD-1 及PD-L1的mRNA 和蛋白均存在高度表达，且表达水平与肿瘤直径、肿瘤转移密切相关。本研究应用免疫组织化学的方法检测了PD-L1、PD-1分子在三阴性乳腺癌、非三阴性乳腺癌组织中的表达情况，分析与各临床病理参数之间的相关性，发现三阴性乳腺癌癌组织中PD-1、PD-L1 阳性表达率显著高于非三阴性乳腺癌组织（P＜0.05），且进一步分析发现PD-1、PD-L1 阳性表达率与患者高组织学级别、淋巴血管侵犯以及淋巴结转移情况密切相关，与既往研究结论一致，提示PD-1/PD-L1 通路激活促进了肿瘤发生免疫逃逸，起到了免疫负调控的作用，其可能通过多种机制参与了肿瘤的进展。以PD-1/PD-L1 靶点为代表的肿瘤免疫治疗为三阴性乳腺癌患者带来了新的希望，其靶向药可能会进入TNBC 患者的治疗方案。

越来越多的研究表明，肿瘤微环境对肿瘤的发生和演进起着不容忽视的重要作用。机体组织正常状态下少有免疫细胞浸润，但是在发生肿瘤时却出现大量的免疫细胞浸润。肿瘤浸润性淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes，TILs），虽然不能直接识别和杀伤肿瘤细胞，但其对抗体的生成以及肿瘤杀伤细胞的活化具有辅助、放大效应[15]。近年来研究发现[16，17]，除PD1 及其配体PD-L1 外，FOXP3 同样能够阻碍机体的免疫系统对肿瘤的监视，为肿瘤细胞免疫逃逸提供有力环境，促进肿瘤的发展。Hou J 等[18]和苏伟[19]以胃癌和结肠癌患者为研究对象，发现FOXP3 表达与肿瘤分期及分化程度相关。Zhang H等[20]研究显示，宫颈癌组织中存在FOXP3 的高度表达，且其表达水平与患者高组织学级别显著相关。Zhang L 等[21]研究发现在乳腺癌组织中FOXP3+Treg细胞的分布方式和数量不同，并且与乳腺癌患者的预后有关。本研究发现，三阴性乳腺癌组织中调节性T 淋巴细胞FOXP3 阳性表达率高于非三阴性乳腺癌组织（P＜0.05），且与高组织学级别、淋巴血管侵犯情况相关，与既往研究结论一致，由此推断在乳腺局部微环境中，负性因子FOXP3 的免疫抑制作用增强，并且此种免疫负性调节作用是随着肿瘤恶性分化程度的加重而加剧的。

综上所述，三阴性乳腺癌患者癌组织中存在PD-1、PD-L1、调节性T 淋巴细胞FOXP3 的高表达，且其表达水平与乳腺癌患者高组织学级别、浸润与转移密切相关，当然，尚需大宗病例深入的研究来证实PD-1/PD-L1 作为TNBC 生物标志物的可行性，甚至制定出三阴性乳腺癌PD-1/PD-L1 检测指南来筛选适合的患者进行肿瘤免疫治疗。