干眼症小鼠泪液中胸腺基质淋巴细胞生成素和白介素18水平变化及相关机制研究

胡文静，沈红良，张 萌，延新年

(1.延安市中医医院眼科,陕西 延安716000;2.西安交通大学第一附属医院检验科,陕西 西安710061;3.咸阳市第一人民医院青光眼综合眼病中心,陕西 咸阳712000)

干眼症在临床上比较常见，在临床上主要表现为泪液异常、眼烧灼感、眼异物感、眼痒、眼红、泪膜不稳，伴或不伴随眼部不适，严重时可能会导致视力障碍甚或失明[1]。该病多发生于女性，亚洲人多于其他人种，老年人多于青年人[2]。胸腺基质淋巴细胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin，TSLP)是一种上皮细胞来源的细胞因子，相关研究[3-5]表明：其在Th2细胞介导的过敏性炎症中发挥重要作用，并在人体天然免疫以及适应性免疫能力方面具有调控作用。炎症因子可参与眼部多种疾病的发生、发展，包括巩膜炎、难治性葡萄膜炎、角膜炎等[6]。特别是白介素(Interleukin，IL)-18可诱导Th1细胞产生细胞因子，从而减少泪液分泌，诱导干眼症的发生[7]。本研究探讨了TSLP、IL-18在干眼症小鼠中的水平变化及相关机制，希望为明确干眼症的发生机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料 实验动物：64只健康雄性BALB/c小鼠(体重18～22 g，6～8周龄，眼前节、眼底无异常)，购于常州卡文斯实验动物有限公司，为无特定病原体级实验动物(SPF级动物)，交替的12 h明暗周期，湿度(60±10)%，室温(25±1)℃饲养。主要仪器及试剂：小鼠IL-1β、IL-18、TSLP 酶联免疫检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，裂隙灯显微镜(上海美沃精密仪器有限公司)，可见光分光光度计(上海光学仪器一厂)，苯扎氯铵粉末(美国Sigma公司)，荧光素钠溶液(上海生工公司)。

1.2 干眼症小鼠模型的建立 所有小鼠适应性喂养1 周后，随机分为对照组与模型组各32只。模型组小鼠双眼均滴入5 μl 0.2%苯扎氯铵溶液(0.2 g苯扎氯铵粉末溶于99.8 ml双蒸水)，每天2次，连续15 d，诱导小鼠干眼模型[8]，在第7、10、15天记录泪液分泌量，评估干眼情况，取最接近均数的小鼠纳入以下实验。对照组给予等剂量(5 μl)的磷酸盐缓冲液滴双眼，每天2次，连续15 d。

1.3 观察指标 ①泪液分泌实验(SIT)：取酚红棉线，置于小鼠右眼外眦中外1/3 左右处，计时1 min，测定酚红棉线红色部分的长度，换算为泪液分泌量。②角膜荧光素染色(FL)评分：用1 μl 10 g/L 荧光素钠滴眼液滴入小鼠结膜囊中，在裂隙灯下观察各组角膜上皮缺损状况，0分：无染色；1分：轻度染色<5个点；2分：中度染色≥5个点；3分：重度染色≥5个点。角膜分为上区、下区、中央区、鼻侧区、颞侧区等5个区得分相加即为染色评分。③泪膜破裂时间(BUT)检测：用1 μl 10 g/L 荧光素钠滴眼液滴入小鼠结膜囊中，在裂隙灯钴蓝光下观察记录角膜染色区出现第1个破裂点的时间。④IL-18、TSLP水平检测：收集两组小鼠的泪液，1000～1500 r/min离心10 min，取上层泪液，采用酶联免疫法检测泪液中IL-18、TSLP水平，检测过程严格按照试剂盒说明书进行操作。⑤所有小鼠经过上述实验后进行处死，行HE染色及透射电子显微镜观察并拍照记录。

2 结 果

2.1 两组SIT与BUT值变化对比 两组实验第1天的SIT与BUT值对比差异无统计学意义(均P>0.05)，模型组实验第15天的SIT与BUT值低于对照组，也低于实验第1天，对比差异均有统计学意义(均P<0.05)，见表1。

表1 两组不同时间点SIT与BUT值变化对比

2.2 两组FL评分对比 两组实验第1天的FL评分对比差异无统计学意义(P>0.05)，模型组实验第15天的FL评分高于对照组，也高于实验第1天，对比差异均有统计学意义(均P<0.05)，见表2。

表2 两组不同时间点FL评分对比(分)

2.3 两组泪液IL-18、TSLP水平对比 两组实验第1天泪液IL-18、TSLP水平对比差异无统计学意义(P>0.05)，模型组实验第15天泪液IL-18、TSLP水平显著高于对照组和实验第1天(均P<0.05)，见表3。

表3 两组不同时间点泪液IL-18、TSLP水平对比(ng/L)

2.4 两组病理特征对比 HE染色特征：对照组：角膜为整齐紧密排列的5层左右上皮细胞，基底细胞为单层柱状上皮细胞层；模型组：角膜上皮细胞层数为9层左右，角膜表面欠光滑，伴有表层上皮细胞损伤、脱落。电镜特征：对照组：角膜上皮细胞会向外伸出许多微绒毛和微皱襞，可见丰富的微绒毛，呈指状突起；模型组：角膜上皮微绒毛可见明显缺失、脱落、减少，排列紊乱。

2.5 相关性分析 在模型组中，直线相关分析显示实验第15天的泪液TSLP与IL-18、FL评分、SIT、BUT都存在相关性(均P<0.05)，见表4。

表4 干眼症小鼠泪液TSLP水平与其他指标的相关性

3 讨 论

干眼症是眼表疾病中常见的疾病之一，也被称为角结膜干燥症。该病在临床上主要表现为畏光、眼部充血、视物模糊、眼睛干涩、有异物感等，对患者生活质量具有严重不良影响[9]。其主要治疗方法人工泪液治疗，即：将人工自然滴眼液(含右旋糖酐、氯化钾、氯化钠等成分)滴于眼部表面进行治疗[10]。干眼症的具体发病机制还不明确，不过可能与内分泌失衡、细胞凋亡、炎症反应、神经机能障碍等多种因素有关，当泪液分泌或排出系统功能异常时，泪膜成分平衡因此而受到破坏，导致眼表正常的修复或防御机制受到损伤，并使泪膜的稳定性下降[11]。苯扎氯铵滴眼可以造成机体泪膜破裂时间缩短与泪液分泌量减少，并伴随有眼表上皮损伤、杯状细胞减少、角膜上皮鳞状化生等眼表结构功能的变化，是当前应用比较多见的干眼动物模型制作方法[12]。本研究显示模型组实验第15天的SIT与BUT值低于对照组，也低于实验第1天，对比差异都有统计学意义;模型组实验第15天的FL评分高于对照组，也高于实验第1天，对比差异都有统计学意义,表明干眼症小鼠模型建立成功。

泪膜主要是由眼眶周附属腺体、眼表上皮细胞分泌而形成的混合液体所组成，其主要功能是保持正常眼表健康，修复眼表的受损表面。正常眼睑关闭、充分的泪液量、规律瞬目、正常的泪膜组成是保持眼前泪膜稳定的主要影响因素[13]。健康人眼表面存在免疫性炎症细胞，可以通过多种机制调控眼部免疫及炎症反应，并使两者维持平衡稳定状态[14]。泪膜出现异常会使得眼表正常修复功能受损，导致眼表面的正常防御平衡受到破坏，从而引发眼表和泪腺的炎症反应[15]。TSLP是一种来自于上皮细胞的细胞因子，具有IL-18分泌调控作用，可通过多种信号通路激活树突状细胞，诱导Th2的炎性反应。TSLP在Th2细胞介导的过敏性炎症反应、天然免疫、适应性免疫中都具有良好的调节作用[16]。本研究显示两组实验第1天的泪液IL-18、TSLP水平对比差异无统计学意义，模型组实验第15天的泪液IL-18、TSLP水平显著高于对照组及实验第1天，表明干眼症小鼠伴随有泪液IL-18、TSLP的高表达。从机制上分析，TSLP处于较高水平时有助于抑制神经递质的释放水平，促进泪液IL-18的表达，降低泪液的分泌水平，从而诱发干眼症的发生[17]。

干眼症患者眼表面通常出现天然的抗炎因子的分泌量下降、而炎症因子分泌量上升，即炎症反应平衡受到破坏，此外细胞凋亡、激素、神经调节等也是导致干眼症发病的重要因素。有研究将培养的人角膜上皮细胞暴露于浓度逐渐增高的氯化钠溶液中，炎症因子可出现浓度依赖性升高的现象，同时TSLP mRNA基因呈现高表达[18]。本研究直线相关分析显示干眼症小鼠实验第15天的泪液TSLP与IL-18、FL评分、SIT、BUT都存在相关性。从机制上分析，TSLP具有IL-18作用，主要是与树突状细胞表面的TSLP 受体结合，通过多种信号通路激活启动过敏反应，从而参与干眼症的发生与发展[19-20]。本研究也存在一定的不足，没有进行多时间点的动态分析，且相关机制分析不够深入，将在后续研究中深入探讨。

总之，TSLP在干眼症小鼠泪液中呈现高表达水平，可能抑制神经递质的释放，促进泪液IL-18的表达，降低泪液分泌，从而诱发干眼症的发生，其具体机制还需进一步探讨。