新型石英晶体微天平分子键裂免疫传感器的研制

张润 司士辉 扶梅 冯浪霞

中南大学化学化工学院，湖南长沙 410083

0 前言

石英晶体微天平（quartz crystal microbalance，QCM）是一种常用的检测负载质量的声波传感器，其生物传感器在应用中一直存在非特异性结合的干扰问题，杂质附着位点导致对目标物质的检测存在较大误差，而分子键裂方法可以有效解决这个问题[1]。调幅调频分子键裂方法可实现不同强度分子键的差异性断裂，甩脱掉表面结合强度较弱的非特异性吸附干扰物，提高生物检测的抗干扰性及检测精度，可实现亲和性生物传感界面的原位再生[2]。DULTSEV F N等[3]首次提出了通过电噪声监测抗原抗体键裂的方法，分别对聚苯乙烯与金、链霉亲和素与生物素以及酰胺键进行了键裂实验，不同强度的相互作用随着电压变化幅值升高依次断裂。COOPER M A等[4]提出了键裂扫描概念（rupture event scanning，REVSTM），通过键裂的方法检测细菌并定量样品中的细菌数，增加QCM的振荡幅度检测细菌与表面相互作用破裂时的声噪声，可定量至少超过6个数量级，检测10种细菌。DULTSEV F N等[5]利用QCM快速检测乙型肝炎病毒，通过病毒从QCM表面振荡脱离的电压，可检测大约140～150个单独的病毒。YUAN Y J等[6]设计了生物素和链霉亲和素相互作用的键裂实验，通过检测QCM的基频及3次谐波附近的窄带频率响应和“噪声”信号监测键裂过程，并根据键能大小区分抗原。KHOBRAGADE S等[7]通过在石英晶体谐振器固定抗大肠杆菌适体在非线性范围内检测大肠杆菌（E. coli），得到3次傅立叶谐波（3f）电流的变化与大肠杆菌浓度定量相关性，灵敏度为105～108 cfu/mL。通过谐振调幅引起分子键裂得到频率响应和电噪声响应，可以检测晶体表面负载质量并区分不同生物分子附着亲和力，得到相应的力学参数和热力学参数。本研究基于DDS数字信号发生器开发了一种调幅调频石英晶体微天平频率检测系统，与文献中应用的方法不同，采用了差频的方法得到分子键裂时的频率信号，实时监测谐振调幅后的信号变化，并通过频率信号和激励电压区分不同生物分子间相互作用的强弱。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

9.98 MHz石英晶体（深圳市仁路科技有限公司）；AD 9854信号发生器（美国Analog Devices公司）；PID控温系统（日本株式会社），流动注射泵（南京润泽流体控制设备有限公司）。KCl、NaCl、Na2HPO4、KH2PO4等试剂为分析纯，均购于国药集团化学试剂有限公司；免疫球蛋白IgG、蛋白质A等为分子生物学级，购于上海生工生物工程有限公司。

1.2 分子键裂型QCM生物传感系统原理及构造

1.2.1 仪器原理

分子键裂型石英晶体微天平生物传感系统工作原理是通过Arduino单片机控制数字信号发生器DDS 9854产生频率可调的正弦波，并激励9.98 MHz镀金电极的压电石英晶体。本系统采用了石英晶体自主谐振电路法和被动激励振荡法两种方式。运行过程中，在低振幅（2 V）下以自主谐振电路法测定晶体频率；在谐振调幅模式时，通过高速继电器切换到被动调幅激励电路，由数控放大器调节不同激励电压实现谐振调幅，增大石英晶体表面剪切动量，使晶体表面物质摇摆速度增快，从而实现分子键裂。仪器原理图如图1所示。

1.2.2 DDS信号发生器

采用美国ADI公司AD 9854高度集成的芯片，由Arduino控制产生频率和相位都非常稳定、幅度编程可调的正弦信号。通过直接数字频率合成（direct digital synthesis，DDS）技术以数控振荡的方式产生频率和相位可控的正弦波，并激励压电石英晶体，通过信号发生器中的D/A转换器将数字信号转变为模拟信号，产生高分辨率、低噪声、高精度的频率信号。DDS信号发生器原理图如图2所示。

1.2.3 差频方法

分子键裂型石英晶体微天平生物传感系统采用了差频方法来获得谐振频率，以DDS信号发生器内可调的频率信号作为参考频率源，不断调节使其与测量晶体频率值在一定范围内，通过差频电路得到测量晶体频率值与基准频率源的差值，即差频信号值，从而提高测量精度。参考频率信号和检测频率信号经混频电路，输出即为差频值。在相同电路中得到差频值，可有效减小温度、电容、晶体老化、阈值电压等对检测的影响。

1.2.4 传感系统构造

谐振调幅压电石英晶体分子键裂生物传感系统包括软件部分和硬件部分，实物和内部结构如4图所示。软件部分包括信号放大模块、数据处理模块、频率存储模块；硬件部分包括差频电路板、调幅电路板、易拆卸检测池（9.98 MHz晶振）、流动注射泵、SD卡存储器、7英寸液晶显示触摸屏、PID控温模块、USB电脑串口。石英晶体工作频率为5～90 MHz，频率分辨率为±1 Hz。可3倍、5倍调幅谐振。10 MHz以下电压可达21.00 V，分辨率为1 V，激励电压调节精度为±10 mV。

根据传感系统的要求，以及目前的微电子技术，谐振调幅传感系统的结构为图5所示的电源、DDS信号发生、QCM、信号采集处理及其他5个模块。

谐振调幅生物传感系统主要分为5个模块，各模块功能为：（1）电源模块：在室外，通过两个12 V的移动电源供电；在实验室内，通过电源适配器给仪器供电并使用LM 2596电源调节器调节电源，保证仪器电压稳定正常；（2）DDS信号发生模块：单片机Arduino控制DDS 9854产生可调正弦波，以振荡法激励QCM使其振荡，信号放大经过低通滤波器（LPF）之后相敏检波，得到参考频率差，通过数控放大器（AMP）调节不同激励电压；（3）QCM模块：采用AT切型9.98 MHz双面金电极石英晶体，设计了方便拆卸的石英晶体检测池和配套的电极底座，如图6所示；（4）信号采集处理模块：QCM响应信号由滤波器滤波处理后，经过模数转换器（ADC）后，再经放大器（AMP）并联电路增益电压信号；（5）其他模块，包括流动注射系统，如图6（c）所示、PID控温系统，如图6（d）所示、散热系统、数据显示存储模块等。

1.2.5 软件系统

本系统采用C++语言，对Arduino、PID控温系统和流动注射系统进行编译。打开仪器后，在选择面板选择等幅（2 V）模式和调幅电压模式，设置温度及流速，采集并自动存储数据。

2 结果与讨论

2.1 仪器性能测试

参考频率默认为10.00 MHz。使用9.98 MHz的压电石英晶振，开机进行自主等幅谐振（振荡电压2 V）频率检测，待初始频率稳定，选择5.00～12.00 V电压调幅。先以3 min的等幅模式测基准频率，再自动调至5.00 V激励模式，调幅30 s，按中断键后记录调幅后的频率信号3 min；之后为30 s的12.00 V调幅模式，记录调幅后的频率信号，检测仪器在气相、液相（纯水、PBS中）调幅后频率的变化稳定性。

2.1.1 仪器的稳定性

在空气中，仪器在等幅模式的差频响应值见图7（a），频率信号大致为一条直线。在检测50 min内，以基频为参考，频率相对偏差为0.981 Hz，波动不超过±1 Hz，频率变化值为0.08 Hz/min。在调幅模式下，频率响应见图7（b），5.00 V和12 .00 V电压激励30 s后，频率变化在10 s内迅速恢复稳定。不同调幅电压激励后的差频值见图7（c），总的频率变化为11 Hz，平均变化0.65 Hz/V，说明在气相中仪器在不同调幅电压下频率响应稍有波动，但在一定范围内稳定。在纯水中，仪器在等幅模式的差频响应见图7（d），频率响应几乎为一条直线，在检测的30 min内，频率变化相对偏差为1.756 Hz，变化值为0.33 Hz/min。仪器在调幅模式下的频率响应见图7（e），在5.00 V和12.00 V电压激励30 s后，频率迅速升高，但在30 s内恢复基频。在不同调幅电压激励后的差频值见图7（f），总的频率变化为24 Hz，平均变化1.41 Hz/V。在纯水环境中，仪器测定的频率波动较气相中更大，主要是受温度和激励电压变化的影响。以上实验表明，仪器在气相和液相中晶体都能正常起振，稳定性良好。

2.1.2 流动注射条件下的稳定性

在等幅模式下，转动流速选择旋钮，通过流动注射泵以不同流速注入磷酸缓冲溶液（PBS），3 min内不同流速下的频率信号响应如图8（a）所示，在同流速下，频率信号几乎为一条直线，调节不同流速后频率稍有变动，但仍稳定。不同流速下注入PBS的频率信号变化的相对偏差如图8（b）所示，不同流速下频率相对偏差小于4 Hz，在500 mL/min流速下相对偏差最小为1.625 Hz，说明仪器在流动注射PBS溶液下，晶体正常起振且信号稳定。

在等幅条件下，以500 mL/min流速流动注入PBS溶液，差频变化如图9（a）所示，频率响应大致为一条直线，在0～17 Hz的范围内波动，在22 min内，频率平均变化值为0.766 Hz/min。频率波动较气相和纯水中更大，主要原因是晶体频率变化与粘度和密度相关，PBS的粘度和密度比纯水大，且频率信号容易受温度的影响。仪器在调幅模式下流动注入PBS的差频值见图9（b），在5.00 V电压激励30 s后，频率几乎无变化。在12.00 V电压激励30 s后，频率迅速升高，在50 s内恢复稳定，受调幅电压的影响，频率变化较大，主要是由于溶液粘度和密度的影响，使晶体剪切振动加剧，但在短时间内可恢复稳定，不会影响键裂实验结果。在不同调幅电压激励后的差频值见图9（c），频率变化为28 Hz，平均变化1.65 Hz/V，随着激励电压升高，频率变化升高，这主要受温度及PBS溶液本身性质的影响。在流动注入PBS溶液下，调幅电压激励后，晶体可正常起振，且在一定范围内稳定性良好。

2.2 键裂实验

2.2.1 调幅电压激励抑制蛋白质A和IgG结合过程

将晶体固定于流动注射系统配套检测池，打开仪器，检测初始频率；待频率稳定，打开流动注射泵，以500 μL/min的流速注射0.1 mg/mL PBS溶液，当溶液流过晶体，频率急剧下降；待频率稳定，记录基本频率f0，将准备好的2 mL，包含0.01 mg/mL蛋白质A的PBS溶液（pH=7.4）注入流通池中并孵育1 h；将蛋白质A固定在导电层表面，然后把不同浓度的IgG的PBS溶液注射到流通池中，以0.1 mg/mL的IgG和0.01 mg/mL蛋白质A的相互作用进行键裂实验；待结合稳定后开启不同电压的调幅模式，激励30 s后记录调幅后的频率数据。

每次注射IgG后频率有所降低，说明IgG分子与蛋白质A结合被吸附在了QCM的表面。不同浓度下存在吸附和平衡两个阶段，其中，不同浓度下的频率变化值如图10（a）所示，QCM的频率变化随着IgG浓度的增大而增大。在不同调幅电压下抑制IgG和蛋白质A相结合，结果如图10（b）所示，随着调幅电压升高而抑制增加，从5.00 V电压到20.00 V其抑制率在12.83%到42.78%之间，说明在蛋白质A和IgG相互作用时，施加的调幅电压越高，抑制二者结合的效果越明显。

2.2.2 蛋白质A和IgG结合后的键裂响应

将蛋白质A固定于晶体表面，依次注入0.01 mg/mL的BSA和IgG的PBS溶液，频率分别下降54 Hz和233 Hz，其频率变化如图11（a）所示。待频率稳定后开启调幅模式，在不同调幅电压激励下的频率响应如图11（b）所示。在低电压调幅下频率几乎无变动，随着电压升高，在13 V时频率上升了91 Hz，比BSA的结合下降频率高，因为BSA与蛋白质A层结合较弱，由频率值可得，BSA和未结合牢固的IgG被振荡甩脱。在20.00 V电压激励后，频率上升153 Hz，在高调幅电压下甩脱了65.67%结合了的IgG。说明IgG与蛋白质A的相互作用较BSA强，即本传感系统在不同调幅电压下可区分不同蛋白之间相互作用的强弱。

3 结论

本文研制的谐振调幅石英晶体微天平分子键裂型传感系统可实时检测生物分子键裂的过程，通过谐振调幅可抑制分子间的结合过程，在短时间内可获得分子键裂前后的差频信号，区分不同强弱的相互作用，简化了检测过程，可应用于表面固定化亲和性生物检测技术领域。