医用臭氧对宫颈癌细胞增殖和迁移抑制作用的初步研究

李锦程，唐水英，曾 涛，何晓峰

子宫颈癌严重影响女性健康，目前治疗手段包括手术和放化疗，存在易复发和5年生存率较低问题，需要寻求新的治疗手段［1］。臭氧应用于治疗感染、肿瘤辅助治疗以及介入手术已取得良好疗效［2-3］。有研究报道臭氧疗法在兔VX2肿瘤模型中取得一定疗效［4-5］。臭氧通过诱导可控性氧化应激刺激人体适应性抗氧化反应，但不会导致抗氧化剂显著增加。在适当浓度下，大多数肿瘤细胞内源性抗氧化机制通常受到削弱［6］。有研究推测臭氧抗癌作用涉及活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生，ROS积累可抑制核因子（NF）-κB激活，而NF-κB在细胞增殖中起着关键作用［7-8］。同时有研究表明，NF-κB信号通路可能是臭氧作用的主要机制之一，包括刺激内源性抗氧化系统上调、激活免疫功能和抑制炎症过程［9］。目前臭氧已尝试应用于介入治疗输卵管炎症及输卵管梗阻［10-11］。本研究探讨医用臭氧对宫颈癌生长和迁移是否有抑制作用，分析ROS积累、NF-κB信号通路与细胞迁移间的关系，为臭氧介入治疗宫颈癌提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人宫颈癌Hela细胞（中国科学院细胞库），Dulbecco极限必需培养基（DMEM）（高糖）、胰酶、胎牛血清（美国Gibco公司），细胞计数试剂盒（CCK）-8（广州贵灵生物科技公司），N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）、ROS检测试剂盒（上海碧云天生物技术公司），NF-κB、上皮-间质细胞转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相关蛋白抗体（美国CST公司），结晶紫染色液（广州杰特伟生物科技公司），医用臭氧发生器（淄博前沿医疗器械公司）。

1.2 细胞培养与处理

Hela细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM中。研究分别设空白组、NAC处理组、NAC和臭氧共处理组、臭氧组，其中臭氧浓度为半最大效应浓度（concentration for 50%of maximal effect，EC50），由CCK-8检测结果所求得。将细胞消化计数成100 W/mL细胞悬液，取5 mL装入20 mL注射器中，空白组细胞不做任何处理，NAC处理组细胞加入5%体积60 mmol/mL NAC溶液预处理20 min，NAC和臭氧共处理组是在NAC预处理基础上加入等体积臭氧气体颠倒混匀15 min，臭氧组不加NAC，臭氧处理如上。

1.3 CCK-8检测细胞活力

分别用0、5、10、20、30 mg/mL臭氧处理细胞后，将2×103细胞分别种植于96孔板，培养至24 h、36 h、48 h等3个检测时间点后弃去旧培养基，每孔加入100μL CCK-8工作液，于孵箱孵育2 h后用酶标仪在450 nm波长条件下检测吸光度。根据前一步实验得到EC50值和培养时间，由上述分组再进行检测。

1.4 细胞集落实验

4组细胞处理完后，按照500/孔的密度将细胞接种于6孔板中，随后置于孵箱培育，持续培养2周。培养完毕弃去旧培养基，甲醇固定后用结晶紫染色液进行染色摄影并计数。

1.5 ROS水平检测

4组细胞处理完后按100 W/皿密度接种于中皿中，培养24 h后用二氯二乙酸酯（DCFH-DA）探针进行装载，流式细胞仪检测ROS水平。

1.6 划痕实验

在60 mm培养皿背面用马克笔划3条直线，每皿加入200 W细胞，待其长满。将培养基加入注射器中，按其预设4组：空白组（不做处理）、NAC处理组（加入培养体系8%体积NAC溶液预处理20 min）、NAC和臭氧共同处理组（NAC预处理基础上加入等体积臭氧颠倒混匀15 min）、臭氧组（仅加入等体积臭氧气体充分混合15 min）。将上述处理过的培养基加入长满细胞的皿中培养15 min，用枪头沿着画的直线垂直方向进行划痕，弃去培养基并洗涤2次，加入无血清培养基进行培养。于0 h、12 h、24 h等3个观察时间点进行摄影记录，随后进行划痕愈合面积统计和分析。

1.7 Transwell实验

4组细胞处理后，加入到小室的上室，细胞密度为5×104，体积为200μL，培养基中不含血清。下室添加600μL含30%胎牛血清培养基。孵育24 h后用湿棉签去除上室细胞。甲醇固定移行细胞后，结晶紫溶液染色摄影并计数。

1.8 蛋白质印迹法检测NF-κB和EMT相关蛋白

4组细胞处理并培养24 h后进行裂解收集，紫光分光光度计测定蛋白浓度。每组添加100μg蛋白量上样，12%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，200 mA恒流用聚偏二氟乙烯（PVDF）膜进行转膜，10%牛血清白蛋白（BSA）进行封闭，1∶1 000一抗浓度4℃孵育过夜，次日用Tris缓冲0.9%NaCl溶液（TBST）洗膜3次，1∶5 000二抗浓度室温孵育1 h后，再次TBST洗膜3次，电化学发光（ECL）显影。以3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）作为内参对照。

1.9 统计学分析

每次实验均重复3次。采用GraphPad Prism 7.0版软件进行统计学分析，数据结果以±s表示。多组间比较用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 臭氧处理抑制Hela细胞增殖

CCK-8法检测Hela细胞增殖情况见图1①，臭氧浓度5、10、20、30 mg/mL对Hela细胞增殖均有明显的抑制作用，具时间和浓度依赖性，求得24 h时EC50为10 mg/mL，后续实验均以10 mg/mL浓度培养24 h方案；NAC抵消臭氧诱导的Hela细胞增殖抑制作用（图1②）。细胞集落实验表明，臭氧处理可明显减少Hela细胞集落数，同样NAC可对抗一定的臭氧作用（图1③）。

图1 臭氧处理对Hela细胞增殖的影响

2.2 臭氧引起Hela细胞内ROS升高

臭氧处理后，Hela细胞内ROS水平显著升高，而NAC预处理后ROS水平与空白组和NAC处理组差异无统计学意义，见图2。

图2 臭氧处理对Hela细胞内ROS的影响

2.3 臭氧抑制Hela细胞迁移

划痕实验分析显示，臭氧处理后Hela细胞的伤口愈合能力（代表迁移能力）均受到抑制，且在12 h、24 h时点差异均有统计学意义（图3①②）；Transwell实验结果显示，臭氧抑制Hela细胞迁移能力与划痕实验一致（图3③④）。

图3 臭氧处理对Hela细胞迁移的影响

2.4 臭氧抑制Hela细胞NF-κB信号通路表达

臭氧处理结果显示，Hela细胞NF-κB和κB抑制性蛋白激酶（IKK）α表达及其磷酸化水平均降低，同时EMT相关波形蛋白（vimentin）和β-连环蛋白（catenin）表达水平降低，见图4。此外，NAC预处理细胞可在一定程度防止臭氧诱导NF-κB信号通路蛋白和EMT相关蛋白vimentin和β-catenin表达降低。

图4 臭氧对Hela细胞NF-κB信号通路和EMT相关蛋白的影响

3 讨论

臭氧对部分癌细胞有抑制增殖效果的机制尚不明确。本研究显示臭氧对宫颈癌Hela细胞氧化应激发生了作用，导致ROS在细胞内聚集，使细胞内NF-κB信号通路和EMT相关蛋白发生改变，表现为增殖和迁移受到抑制。

臭氧是臭氧发生器利用医用纯氧电离产生的臭氧-氧气混合气体［12］。臭氧在介入治疗领域已取得广泛应用，如治疗缺血性疾病、炎症疾病和癌症［10，13-14］。有研究报道臭氧可对膀胱癌［15］、腺癌［16］和胶质母细胞瘤［17］有间接作用，能抑制其进展。本实验发现臭氧处理后，Hela细胞内ROS有明显增加。ROS是氧活性形式，其过量产生可导致大分子氧化，引起DNA突变和细胞死亡［18］；ROS积累会抑制NF-κB表达［7］。研究结果显示NF-κB信号通路在多种肿瘤如宫颈癌、肝癌、胃癌、胰腺癌等进展中发挥重要作用［19］；NF-κB激活与肿瘤细胞生存、增殖、血管生成、扩张和转移相关［20］；臭氧可能是潜在的NF-κB抑制剂［21］。因此，臭氧通过增加ROS产生增加氧化应激抑制NF-κB表达，可能是一种潜在的治疗策略。

EMT是各种癌症进展期一至关重要的事件，与肿瘤侵袭和转移密切相关。研究证实多种实体肿瘤在发生侵袭和转移的同时，常伴有肿瘤细胞EMT［22］。Vimentin是EMT中重要因子，属间质源性，在正常细胞中表达量低或不表达，而在许多上皮肿瘤中高表达，是间质细胞迁徙的重要调节者，在肝癌、胃癌等恶性肿瘤中均能直接促进肿瘤侵袭、转移，其表达量与肿瘤预后呈负相关［23-24］。β-catenin是一种多功能可溶性蛋白，介导体内许多生物过程，包括细胞增殖、黏附、分化等，在正常组织和良性上皮肿瘤中维持低水平，而在恶性肿瘤中表达阳性率可达50%以上，其表达量与肿瘤细胞侵袭转移能力呈正相关［25-26］。本研究显示臭氧处理后vimentin和β-catenin表达降低，提示臭氧影响细胞增殖迁移可能与影响EMT相关蛋白有关。

综上，医用臭氧可能通过抑制NF-κB信号通路下调vimentin、β-catenin抑制宫颈癌Hela细胞增殖和迁移，ROS在其中发挥重要作用，表明医用臭氧有望成为宫颈癌新的辅助治疗手段。