喷施硝酸镧对脐橙叶片渗透调节物质的影响

陈 璐，张小丽，高 柱，卢玉鹏，王小玲

（1江西省科学院生物资源研究所，南昌 330096；2井冈山生物技术研究院/江西省科学院井冈山分院，江西吉安 343016）

0 引言

中国是稀土资源大国，作为世界稀土中心，稀土储量位居世界首位，稀土含量约占世界总储量的23%，占世界总产量的90%以上[1-2]。稀土元素因其独特的理化性质，对植物生长具有一定的生理调控特性，同时稀土离子还可与细胞质膜上的生物大分子结合形成比较稳定的复合物，增强氧化酶活性以及减少电解质外渗，改变细胞膜的通透性和稳定性，降低膜脂过氧化过程中产生的有害物质，提高细胞膜的保护功能与渗透调节物质积累，从而增强植物对逆境的抵御能力[3-4]。其中，稀土元素镧在地球上的蕴藏量较高，同时其化学性质活泼、水合离子半径小且对植物生长负面影响小，已被确认为作物的生理活性物质，在调控作物生长、产量和品质方面表现出“低促进高抑制”的影响作用，即适宜浓度处理时，可打破种子休眠促进萌发、促进生长发育、提高作物产量、改善果实品质、增强植物抗性、缓解不利胁迫等作用[5-7]；当处理浓度较高时，植物体内蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性受到抑制，干物质含量与叶绿素含量下降，抑制了根茎叶的生长，同时镧的重金属特性也会抑制作物体内特定酶的活性和结合蛋白，进而产生毒害作用，对作物造成伤害[8]。

稀土和脐橙是江西赣南地区的主要经济支柱产业，赣南地区也因此享有“稀土王国”与“中国脐橙之乡”的美誉，脐橙在中国柑橘类水果中占据着重要地位，主栽品种‘纽荷尔’脐橙(Citrussinensis(L.)Osbeck‘Newhall’)的种植面积占全国种植面积的85%以上[9-11]。大量研究表明赣南脐橙风味浓厚、品质上乘，与土壤中的稀土含量关系密切，稀土含量较高的土壤更有利于脐橙果实中营养物质的形成、积累[12-13]。然而，稀土元素在果树上的应用研究主要集中在提高果园产量、改善果实品质和增强果树抗性等方面[14-15]，针对稀土镧元素对‘纽荷尔’脐橙渗透调节影响的生理机制研究的报道较少。渗透调节(Osmotic adjustment)是指植物体因低温、高温、干旱、盐碱等逆境导致的水分胁迫下，植物体内通过主动积累细胞内的无机离子或细胞合成的有机溶质等渗透调节物质来提高细胞液浓度，降低渗透势，提高细胞吸水或保水能力，是植物适应逆境胁迫的重要生理过程，许多研究表明植物通过主动积累可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸等分子量小、容易溶解的重要渗透调节物质来维持细胞的渗透平衡与正常的生理代谢[16]。

本研究以‘纽荷尔’脐橙为试验材料，采用不同浓度的硝酸镧溶液喷施处理叶片，通过测定处理后1天当中不同时间(0～24 h)叶片渗透物质含量变化规律，探讨稀土元素镧对脐橙叶片渗透调节物质影响的作用机理，为进一步研究稀土元素对脐橙生理代谢的调控以及预防稀土元素镧的环境毒理效应提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为2年生‘纽荷尔’脐橙嫁接苗，于2020年2月移栽至直径为60 cm的花钵中，每盆栽植1棵幼苗。供试盆栽土壤采自江西省科学院园艺植物高值利用研究基地（海拔64.35 m，28°40'17''N、115°18'31''E），每盆装10 kg土壤，装盆后进行移栽并进行合理的田间管理。

1.2 试验方法

2020年7月中旬，选择晴朗天气，于上午8:00喷施4种不同浓度的硝酸镧溶液：0、50、150、300 mg/L，以0 mg/L处理作为对照(CK)。每个处理喷施5棵幼苗，3次重复。分别于当天上午喷施前8:00和喷施后10:00、12:00、16:00、20:00和次日上午8:00（以下记录为处理时间：0、2、4、8、12、24 h）采集植株中上部当年生嫩叶。每个处理采集的叶片剪碎，混匀后，液氮迅速冷冻，于-80℃超低温冰箱保存备用。

1.3 渗透物质含量测定

采用蒽酮比色法测定可溶性糖含量，于620 nm测定其吸光值[17]，采用考马斯亮蓝G-250染色法(Coomassie brilliant blue G-250)测定可溶性蛋白含量[18]，采用酸性茚三酮比色法测定游离脯氨酸含量[19]，采用岛津UV-8000S紫外可见分光光度计进行分析测定。

1.4 数据分析

试验数据取3次重复试验的平均值，利用Microsoft Excel 2010处理数据和绘图，SPSS 17.0软件进行数据统计分析与单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度硝酸镧对脐橙叶片可溶性糖含量的影响

可溶性糖是作物细胞中调节渗透平衡的小分子有机化合物，具有维持细胞渗透平衡和细胞膜系统稳定性等重要生理功能。图1表明，处理的24 h之内，脐橙叶片可溶性糖含量呈现逐渐下降的趋势。其中，当硝酸镧处理浓度为50 mg/L时，叶片可溶性糖含量降低最快，处理12 h后降低了44.17%，处理24 h后降低了47.50%；当硝酸镧处理浓度为150 mg/L和300 mg/L时，叶片可溶性糖含量降低比较缓慢，处理12 h后分别降低了22.39%与19.74%，处理24 h后分别降低了42.82%与36.16%。另外，随着硝酸镧处理浓度增大，叶片平均可溶性糖含量积累增加，50 mg/L、150 mg/L和300 mg/L处理后，叶片平均可溶性糖含量显著高于CK，分别是CK的1.06倍、1.11倍和1.12倍；且150 mg/L和300 mg/L处理对促进叶片可溶性糖含量积累的作用差异不明显。由此表明，硝酸镧处理虽然不能改变脐橙叶片可溶性糖含量积累的趋势，但是可以明显促进叶片可溶性糖含量的积累，降低细胞液渗透势，以此适应外界变化。

图1 不同浓度的硝酸镧对脐橙叶片中可溶性糖含量的影响

2.2 不同浓度硝酸镧对脐橙叶片可溶性蛋白含量的影响

在硝酸镧处理的0～24 h期间，脐橙叶片中可溶性蛋白含量呈现先上升后下降趋势（图2）。当硝酸镧处理浓度为50 mg/L时，叶片可溶性蛋白含量峰值出现的时间与CK相同，均在处理后4 h达到，分别是处理前的2.45倍和2.02倍；当处理浓度为150 mg/L与300 mg/L，叶片可溶性蛋白含量峰值出现的时间在处理后8 h，较对照延迟了4 h，分别是处理前的1.90倍和2.29倍。进一步分析表明，当硝酸镧处理浓度为50 mg/L和150 mg/L时，脐橙叶片可溶性蛋白平均含量显著高于CK，分别是对照的1.32倍和1.20倍；当处理浓度为300 mg/L时，脐橙叶片可溶性蛋白含量显著低于CK，是对照的0.66倍。可见，随着硝酸镧处理浓度增大，脐橙叶片可溶性蛋白平均含量降低，因此促进脐橙叶片可溶性蛋白含量增加的适宜硝酸镧浓度为≤150 mg/L。

图2 不同浓度的硝酸镧对脐橙叶片中可溶性蛋白含量的影响

2.3 不同浓度硝酸镧对脐橙叶片游离脯氨酸含量的影响

脯氨酸积累是作物应对逆境胁迫的生理表现之一。本研究首先表明不同硝酸镧浓度处理后脐橙叶片中游离脯氨酸含量的变化趋势和CK不尽相同（图3）。其中，CK呈逐渐下降趋势；50 mg/L处理呈先下降后上升的趋势，处理后4 h游离脯氨酸含量达到最低值(619.79 mg/L)，是处理0 h时的0.64倍，随后其含量开始增加，处理后24 h的含量也只为0 h时的0.91倍；150 mg/L与300 mg/L处理均呈先上升后下降的趋势，但是2个处理后游离脯氨酸含量峰值出现的时间不同。150 mg/L处理于4 h时出现最峰值(1039.88 mg/L)，是处理0 h的1.25倍，处理4 h之后，叶片游离脯氨酸含量迅速下降，处理24 h后仅为0 h时的0.57倍；300 mg/L处理脯氨酸含量于8 h时出现积累高峰(1410.84 mg/L)，峰值出现时期比150 mg/L的处理延迟了2 h，随后其含量下降速率由慢转快，处理后12 h时为0 h时的1.29倍，24 h时是0 h时的1.06倍。其次，50 mg/L、150 mg/L和300 mg/L硝酸镧处理后，脐橙叶片游离脯氨酸积累含量均显著高于CK，分别是CK的1.79倍、1.66倍和2.67倍。因此，硝酸镧处理不仅增强了渗透胁迫下脐橙叶片中游离脯氨酸含量的积累，而且适宜脐橙叶片游离脯氨酸含量积累的硝酸镧处理浓度≥300 mg/L，具体浓度还有待进一步研究。

图3 不同浓度的硝酸镧对脐橙叶片中游离脯氨酸含量的影响

3 结论与讨论

受到胁迫（盐胁迫、重金属胁迫等）或处于逆境中（高温、干旱等）会导致植物细胞失水，细胞内外渗透压失衡，而渗透调节是植物抵御外界胁迫或逆境平衡细胞渗透压的重要生理反应，并且渗透调节还具有维持叶片气孔开放与正常光合作用、调节蒸腾与呼吸等生理作用[20]。可溶性糖、可溶性蛋白与游离脯氨酸含量等渗透调节物质是影响植物渗透调节的重要指标，渗透物质的积累可以调节细胞与外界的渗透压平衡，保护细胞膜与蛋白质活性，以此维持细胞的正常生理功能[21-22]。

许多研究表明，可溶性糖是植物体内主要的渗透调节剂，植物在逆境胁迫下会积累可溶性糖，平衡细胞内外的渗透势，降低质膜的损伤程度，通过提高植株的保水能力来增强植物的抗性[23]。作为渗透调节物质的可溶性糖主要包括蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖等，也可以为合成其他有机物提供碳骨架和能量，保持细胞膜结构的稳定性[24]。本研究结果显示，不同浓度硝酸镧处理脐橙叶片后其可溶性糖含量高于CK，可能是由于硝酸镧的加入导致在正常代谢过程中大分子碳水化合物分解加快而合成缓慢，光合产物形成过程中加快了小分子量蔗糖的合成[20]，这也说明脐橙叶片通过主动积累渗透物质可溶性糖，调节细胞渗透压，以此适应由硝酸镧处理引起的外界环境变化，提高植株在逆境胁迫条件下的抗性。

可溶性蛋白是植物体内抵抗逆境胁迫的重要渗透调节物质之一，植物细胞在应对逆境胁迫时往往通过主动积累大量可溶性蛋白来增加细胞渗透压，维持细胞膨压平衡[25]。杨光梅[4]研究发现，适当浓度的镧离子可提高植物体内保护酶活性，减少电解质的外渗，降低膜脂过氧化程度，从而增强植株对逆境或胁迫的抵御能力。本研究发现，硝酸镧与CK处理的脐橙叶片在不同生长时间，其可溶性蛋白含量先上升后下降，处理4 h或8 h后均开始下降，这也说明生长过程中脐橙叶片蛋白质稳定性降低，分解速率加快，合成速率减慢，进而导致蛋白质含量逐渐减少。当硝酸镧处理浓度为50 mg/L和150 mg/L时，对脐橙叶片渗透物质可溶性蛋白质含量积累的促进作用较强；当处理浓度为300 mg/L时，产生明显的抑制作用，这与前人得到的“高抑低促”的结论一致[26]，即适宜的浓度可以提高植物对环境变化或胁迫的适应能力，而过高的浓度则会抑制渗透调剂物质的积累，导致渗透失衡。与此同时，300 mg/L硝酸镧处理是唯一1个处理24 h叶片中可溶性蛋白含量低于0 h的含量，再次证明了高浓度硝酸镧不仅抑制可溶性蛋白的积累，而且对叶片造成的渗透胁迫已超出了其自我修复和调节能力，说明促进脐橙叶片可溶性蛋白含量积累的硝酸镧适宜浓度为≤150 mg/L。

脯氨酸水溶性大、分子量小、对细胞无损害影响，是氨基酸中最有效的渗透调节物质，也是植物抵御逆境的重要有机渗透调节物质[27]。一方面游离脯氨酸积累的多少反映着植物叶片受胁迫伤害程度的大小，另一方面作为亲和性的渗透调节物质维持着细胞内外的渗透平衡，甚至可能直接影响蛋白质的稳定性，对生物大分子的结构与稳定性起一定保护作用[28]。随着硝酸镧浓度的增加，脐橙叶片中游离脯氨酸含量的积累也不断增多，可能是外界镧离子刺激加快了脯氨酸的合成效率或（且）抑制了脯氨酸氧化作用的缘故[20]，体现外界镧离子刺激了渗透溶质不断积累，并参与了渗透调节，通过提高脯氨酸的含量维持细胞的渗透平衡，以此抵御胁迫。

大量研究表明，适宜的硝酸镧浓度可以促进植物通过主动积累可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸等有机小分子物质来提高细胞液浓度，降低细胞内的渗透势，维持细胞膨压以及植物的正常生理功能[29-30]；而镧离子浓度过高时，镧的重金属特性显现，对植株的损伤超出了植物的自我调节能力，造成了细胞渗透压失衡，不仅抑制植株生长，而且影响植物体内酶的活性和结合蛋白，甚至对植株产生毒害作用。本研究结果表明，50 mg/L的硝酸镧处理与CK的叶片可溶性糖、可溶性蛋白与游离脯氨酸含量均在相同的时间出现积累高峰，同时这三者在积累高峰时的含量均高于CK；150 mg/L的硝酸镧处理相较于CK，对叶片中可溶性糖、可溶性蛋白与游离氨基酸含量的积累均有促进作用；300 mg/L的硝酸镧处理虽然促进了可溶性糖与游离氨基酸含量的积累，但抑制了可溶性蛋白含量的积累，推测是由于渗透物质种类不同而引起的差异。

综上所述，脐橙叶片通过主动积累可溶性糖、可溶性蛋白与游离脯氨酸来适应和调节硝酸镧处理造成的细胞渗透胁迫。可溶性糖与脯氨酸含量在50 mg/L、150 mg/L与300 mg/L硝酸镧处理后均促进积累，而可溶性蛋白含量在50 mg/L与150 mg/L硝酸镧处理后促进积累，但在300 mg/L处理下积累受到抑制，呈现“高抑低促”的现象。适宜浓度的硝酸镧通过促进脐橙叶片中可溶性糖、可溶性蛋白与游离脯氨酸的积累，维持细胞渗透压平衡，提高细胞的渗透调节能力，增强植株对环境变化或胁迫的适应与抵御能力；而硝酸镧浓度过高，抑制可溶性蛋白的积累，并对叶片造成伤害。由于渗透物质种类不同，促进脐橙叶片可溶性糖与脯氨酸积累的适宜浓度应为≥300 mg/L，而促进可溶性蛋白积累的适宜浓度为≤150 mg/L。关于硝酸镧促进脐橙叶片不同渗透物质积累的最佳浓度可在此研究基础上深入研究。