鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶和RND外排泵相关耐药基因的研究*

周亚玲，阴 晴，王中新△

1.安徽医科大学第一附属医院检验科，安徽合肥 230022；2.江苏大学附属医院检验科，江苏镇江 212001

近年来，随着广谱抗生素的广泛使用，多重耐药鲍曼不动杆菌(MDRAB)分离率呈逐年上升趋势[1]，而其耐药性的形成与碳青霉烯酶的产生和外排泵过表达关系密切[2-3]。碳青霉烯酶中苯唑西林酶是鲍曼不动杆菌的主要碳青霉烯酶，特别是OXA-23在其中发挥主导作用[4-5]。B类金属酶在各地区的检出率存在明显的差异[6-7]，主要包括blaIMP、blaVIM、blaNDM等基因型。外排泵中的耐药结节细胞分化超家族(RND)[8]与MDRAB形成关系密切，AdeABC、AdeIJK和AdeFGH是其主要类型，其中任何一个外排泵的过度表达都会降低鲍曼不动杆菌对抗菌药物的敏感性[9]。本研究主要检测收集的鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶和RND外排基因的携带情况，再应用实时荧光定量PCR(qPCR)测RND外排泵阳性菌株的adeB、adeJ和adeG表达水平，为及早识别耐药菌以及加强耐药菌的监测提供理论依据。

1 材料与方法

1.1实验菌株 所用菌株分离自江苏大学附属医院2016年7月至2018年6月微生物室保存的非重复性鲍曼不动杆菌101株，其中MDRAB71株，非多重耐药鲍曼不动杆菌(NMDRAB) 30株。参考菌株鲍曼不动杆菌ATCC19606购于国家卫生健康委员会临床检验中心。

1.2主要仪器 Real-Time PCR仪、普通PCR扩增仪和凝胶电泳成像分析系统均购自美国Bio-Rad公司；水平电泳套件购自上海天能生物公司；NanoDrop1000分析仪为美国Termo公司产品；恒温水浴锅购自嘉兴俊思电子有限公司；气浴恒温振荡器购自江苏科技仪器有限公司。

1.3主要试剂 血琼脂平购自郑州安图生物公司；小量质粒提取试剂盒，胶回收试剂盒购自上海捷瑞生物有限公司；2×qPCR SYBR Green Mix、2×PCR Master Mix、QRT SuperMix for qPCR购自南京Vazyme公司；细菌总RNA快速抽提试剂盒购自上海生工生物公司；DNA Marker购自大连宝生物公司；PCR引物由无锡天霖生物科技有限公司合成；琼脂糖粉末购自西班牙Biowest公司。

1.4方法

1.4.1细菌DNA模板的制备 采用煮沸裂解法制备细菌总DNA，操作步骤为血平板复苏-80 ℃保存的菌株，置CO2恒温培养箱过夜培养，次日用无菌接种环挑取3～5个菌落接种于300 μL灭菌蒸馏水中并振荡混匀，100 ℃煮沸10 min裂解细菌， 12 000 r/min离心10 min后收集上清液即为DNA模板。

1.4.2碳青霉烯酶基因的检测 参照文献[6,10]合成检测引物，具体序列见表1。PCR反应体系为25 μL，包括预混液 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反应程序为94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，51～56 ℃退火30 s，具体退火温度见表1，72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃ 10 min。1.2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1.4.3RND外排泵基因的检测 参照文献[9,11]合成检测引物，具体序列见表1。PCR反应体系同1.4.2。PCR反应程序为94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，53～55 ℃退火30 s，具体退火温度见表1，72 ℃ 1 min，35个循环，72 ℃ 10 min。1.2%琼脂糖凝胶检测PCR产物。

表1 碳青霉烯酶基因和RND外排泵基因引物序列

1.4.4qPCR检测外排泵基因adeB、adeJ和adeG的表达水平 在adeB、adeJ和adeG同时阳性的菌株中随机选取6株MDRAB和4株NMDRAB进行qPCR检测，ATCC19606作为参考菌株。血平板复苏实验菌株，置CO2恒温培养箱过夜培养，次日挑单个菌落于3 mL的LB液体培养基中，置恒温摇床上37 ℃振荡培养8 h后收集菌体，采用RNA快速抽提试剂盒提取细菌总RNA，RT SuperMix反转录试剂盒合成cDNA，用于后续qPCR检测，反应条件为95 ℃预变性8 min、95 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s，反应共40个循环，于退火阶段收集荧光信号，每个标本重复3次。计算平均Ct值，采用2-ΔΔCt法计算被测基因的相对表达量。

续表1 碳青霉烯酶基因和RND外排泵基因引物序列

1.5统计学处理 采用SPSS 25.0软件进行统计分析。对MDRAB与NMDRAB的blaNDM-1、blaIMP、blaOXA-23、adeB、adeJ和adeG基因携带率进行χ2检验；对MDRAB与NMDRAB的adeB、adeJ和adeG基因的表达水平进行t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1碳青霉烯酶基因的PCR结果 71株MDRAB中blaNDM-1(26.8%，19/71)、blaIMP(88.7%，63/71)和blaOXA-23(84.5%，60/71)的检出率明显高于30株NMDRAB中blaNDM-1(0.0%，0/30)、blaIMP(0.0%，0/30)和blaOXA-23(10.0%，3/30)的检出率，差异均有统计学意义(P<0.05)。blaOXA-51的检出率均为100.0%，未检测到blaVIM、blaOXA-24和blaOXA-58，具体电泳结果见图1。

注：M为DL2000marker，blaNDM-1为316 bp，blaIMP为449 bp，blaOXA-23为501 bp，blaOXA-51为352 bp。

2.2RND外排泵基因的PCR检测结果 71株MDRAB中adeB(98.6%，70/71)和adeG(100.0%，71/71)的检出率明显高于30株NMDRAB中adeB(20.0%，6/30)和adeG(90.0%，27/30)的检出率，差异均有统计学意义(P<0.05)；adeJ的检出率均为100.0%。具体电泳结果见图2。

2.3adeB、adeJ和adeG的表达水平 qPCR结果显示：MDRAB菌株adeB、adeG和adeJ的平均相对表达量分别为7.78±2.19、5.31±1.13和1.55±0.38；NMDRAB菌株的adeB、adeG和adeJ的平均相对表达量分别为0.52±0.41、0.46±0.23、1.84±0.13；MDRAB菌株的adeB、adeG和adeJ的相对表达量分别是NMDRAB菌株的14.91倍、11.61、0.84倍，可见MDRAB菌株的adeB、adeG的相对表达量明显高于NMDRAB菌株，差异均有统计学意义(P<0.05)；adeJ的相对表达量在MDRAB和NMRAB菌株之间差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

注：M为DL2000marker，adeB为901 bp，adeJ为222 bp，adeG为236 bp。

注：*P<0.05。

3 讨 论

MDRAB感染具有高发病率和高致死率，一直广受国内外学者的关注，而碳青霉烯酶基因和外排泵高表达是MDRAB形成的主要机制。

本次收集的所有菌株均检测到blaOXA-51。早在2005年，HERITIER等[12]发现blaOXA-51位于鲍曼不动杆菌染色体上。STRATEVA等[13]也发现收集的226株鲍曼不动杆菌均携带blaOXA-51，证实了上述结果。blaOXA-23在本次收集的MDRAB中携带率高达84.5%，其余苯唑西林酶未被检测到，表明blaOXA-23是鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药的主要水解酶，这一结果与国内外研究结果相符[5-6]。本研究发现有3株对碳青酶烯类药物敏感的NMDRAB却检测到blaOXA-23基因，考虑到这3株NDMRAB携带的blaOXA-23基因上游可能缺乏插入序列ISAbal或者插入序列发生突变，ISAbal的出现可以上调blaOXA基因的表达，从而有效增强抗菌药物的水解作用，导致耐药的出现[14]。对金属酶的检测发现，blaNDM-1和blaIMP基因均存在于MDRAB中，blaNDM-1的检出率(26.8%，19/71)与陈娇等[15]报道的结果相符(26.56%，17/64)，低于闫玲等[16]报道的33.33%(14/42)，但是高于TADA等[17]报道的18.52%。blaIMP的检出率与江苏徐州地区报道的86.88%相符[6]，明显高于皖北地区报道的14.3%[18]。在所收集的菌株中未检测到blaVIM基因，表明blaVIM不是江苏大学附属医院MDRAB形成的主要水解酶。本次研究的金属酶阳性率总体处于偏高的水平，应引起高度重视。

MDRAB的另一个重要耐药机制是外排基因的过度表达，外排泵具有广泛的底物特异性，可以将多种抗菌药物排出体外，降低药物抑菌或杀菌作用。RND外排泵在鲍曼不动杆菌的耐药中扮演着至关重要的角色，在其赋予菌株耐药表型的同时，也增强菌株获得其他耐药机制，比如抗菌药物作用靶点的突变、水解酶的产生等[5]。目前RND家族主要包括adeABC、adeIJK、adeFGH、adeDE、adeXYZ，后两种研究较少。本研究通过PCR检测adeB、adeG、adeJ基因来分析外排泵基因adeABC、adeIJK、adeFGH在鲍曼不动杆菌中的分布情况，发现外排泵基因adeB主要分布在MDRAB中，而外排泵基因adeJ、adeG不仅分布在MDRAB中，在NMDRAB中也广泛分布。因此笔者进一步应用qPCR检测adeB、adeG、adeJ的表达，结果显示MDRAB的adeB、adeG表达水平明显高于NMDRAB，表明adeABC、adeFGH的高表达是江苏大学附属医院MDRAB形成的一个重要机制。另外，本次研究发现，所有菌株均携带adeJ。早在2008年DAMIER-PIOLLE 等[19]报道60株鲍曼不动杆菌均检测到adeIJK基因，并且证实adeIJK复合体是鲍曼不动杆菌固有基因，而不是获得性的。本研究结果与该研究一致。

综上所述，碳青霉烯酶的产生以及RND外排泵基因的高表达在江苏大学附属医院MDRAB耐药机制中起到至关重要的作用，通过对耐药机制的深入研究有助于及早识别耐药菌以及为控制多重耐药菌株的形成和医院内播散提供理论依据。