毛竹漆酶基因启动子序列分析及基因表达模式

杨克彬 朱成磊 高志民

(国际竹藤中心竹藤资源基因科学研究所 国家林业和草原局/北京市竹藤科学与技术重点开放实验室北京 100102)

漆酶(LAC) 属于多酚氧化酶，在细胞壁形成、逆境胁迫、花青素形成和酚类物质催化等过程中均发挥着重要作用[1－2]。高等植物的漆酶多数存在于木质化程度较高的组织中，在植物叶和新芽处也有发现[3]。研究表明，拟南芥(Arabidopsis thaliana) 17 个漆酶被划分为6 个亚族[4]，多数漆酶基因属于组成型表达，只有LAC7在根毛中特异表达[5]。同时，漆酶基因的表达本身又受到miRNA 和转录因子的调控。如在落叶松(Larix gmelinii) 体胚中miR397 通过调控靶基因漆酶基因来参与细胞壁的加厚和木质化过程[6]；柑橘(Citrus sinensis) 中miR397a 能够通过调控LAC4和LAC17在应对硼胁迫中发挥着至关重要的作用[7]；过量表达miR397a 的番茄 (Solanum lycopersicum) 中靶基因LeLACmiR397a下调，引起多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD) 和过氧化物酶(POD) 活性降低[8]。转录因子MYB58能够直接激活漆酶基因LAC4，来调控次生壁的形成[9]。另外，漆酶基因的表达还受到环境的影响，如脱落酸 (ABA) 能诱导拟南芥AtLAC4的表达[10]、外界硼胁迫能提高枳(Poncirus trifoliata)中LAC7的表达量[11]。

近年来，随着中国天然林的全面禁伐，木材供给短缺问题更为明显，因此木本竹的开发利用更成为研究的热点。竹材用途广泛，涉及家具、建筑、造纸等各个方面，其中竹浆造纸具有原料易得、成纸光滑等优点，在一定程度上可代替部分木浆造纸。然而，在造纸过程中木质素的降解一直是竹浆造纸工业实现绿色环保的难点之一，利用生物工程手段来调控竹子木质素生物合成将是解决该问题的重要途径。目前，虽然对竹子木质素生物合成酶基因已有报道，如PePAL[12]、C4H[13]、C3H[14]，但对漆酶基因的研究却鲜有报道。前期本实验室从毛竹(Phyllostachys edulis)中克隆了一个miR397的靶基因PeLAC，并通过RLM-5′RACE 的方法验证了miR397对PeLAC的转录后调控关系，分析了PeLAC的组织表达特性及在不同胁迫处理条件下的表达特性[15]，但尚缺乏全基因组水平的全面了解。本文借助新版本毛竹基因组[16]，系统分析了42 个漆酶基因的启动子序列，利用转录组数据研究了基因的表达模式，克隆了启动子序列PeLACp，并构建了瞬时表达载体，在模式植物拟南芥中研究其表达模式，以期为深入研究漆酶基因的功能提供参考。

1 材料和方法

1.1 毛竹漆酶基因启动子序列获取与顺式作用元件预测

在毛竹新版本基因组数据中共鉴定了具有编码完整保守结构域的漆酶基因43 个[17]，因其中1个没有启动子序列信息，所以分别获取了42 个PeLACs 的起始位点上游序列(2 000 bp) 作为启动子，应用在线软件PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/) 分析预测每个基因启动子中所包含的顺式调控元件，并统计做图。

1.2 不同处理毛竹转录组数据获得与漆酶基因表达模式分析

通过文献查询，从发表论文提交到NCBI 公共数据库的Short Read Archive (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/) 中获取毛竹的转录组数据，包括经100 μmol/L 赤霉素(GA3) 溶液处理4 h 的2 个月毛竹幼苗的转录组数据 (SRR6131113～SRR6131118)[18]，经低温和干旱处理2 h 和8 h 的2年生毛竹实生苗叶片的转录组数据(SRR4450542～SRR4450551)[19]，以及本实验室的不同长度根和不同高度笋的转录组数据[16]。根据PeLACs 编号从转录组数据中筛选出其FPKM，采用Log2FPKM 代表基因表达量，并用TBtools 做图[20]。

1.3 启动子序列克隆与测序

以毛竹(P.edulis) 叶片为材料，采用CTAB法基因组DNA 提取[21]。根据毛竹组数据库(http://www.bamboogdb.org/) 中漆酶基因PeLAC20(PH02Gene23801) 的启动子序列PeLACp设计引物，以基因组DNA 为模板，用LAC410-pro-F 与LAC410-pro-R 扩增漆酶基因启动子序列，扩增产物连接到pGEM T-easy 载体，送生工生物工程(上海) 股份有限公司进行测序。

1.4 启动子瞬时表达载体构建

根据PeLACp序列以及植物表达载体pBI101的多克隆位点设计添加酶切位点的引物LAC410-pro-F1 与LAC410-pro-R1 (表1)。以测序正确的PeLACp质粒为模板进行扩增，获得含有酶切位点和启动子序列的片段，用XbaⅠ和BamHⅠ双酶切将启动子连接到植物表达载体pBI101 的多克隆位点，形成PeLACp∶∶GUS融合的表达载体。

表1 引物序列表Tab.1 List of primer sequences

1.5 基因启动子的瞬时表达

将构建正确的漆酶基因启动子与GUS基因融合的表达载体转入GV3101 中，用阳性菌株通过浸花法[22]转化模式植物拟南芥(Col-0)，用卡那霉素(Kan，50 μg/mL) 对转基因植株进行抗性筛选。启动子活性分析:在室温条件下将野生型拟南芥和转基因阳性植株幼苗分别浸泡在GUS 染色液中1 h 或过夜；用70%乙醇脱色至阴性对照为白色；观察并拍照记录。

2 结果和分析

2.1 毛竹漆酶基因启动子序列分析

启动子中分布的顺式作用元件在植物生长发育及响应外界环境胁迫过程中发挥重要的作用，使基因的表达受到激活或抑制，因此启动子对于研究基因功能具有重要价值。对42 个PeLACs 启动子分析结果表明，根据顺式作用元件的功能主要分为3 个类型，即与激素响应相关、环境胁迫相关以及发育相关的顺式作用元件，分别包括9种、7 种和4 种顺式作用元件(图1)。在激素响应相关的顺式作用元件中，脱落酸响应元件(ABRE) 最多，存在于40 个PeLACs 的启动子中，其次是茉莉酸甲酯 (MeJA) 响应元件(CGTCA-motif 和TGACG-motif) 共存在于35 个PeLACs 的启动子中。还中鉴定了GA 响应元件(GARE-motif、P-box 和TATC-box) 和生长素响应元件(AuxRE、AuxRR-core 和TGA-element)，但是它们仅存在于较少PeLACs 的启动子中，如AuxRE 仅有1 个存在于PeLAC25 的启动子中(图1)。

在环境胁迫反应相关的顺式作用元件中，参与环境适应性的顺式作用元件MYB 和MYC 存在于所有PeLACs 的启动子中；其次是与厌氧诱导相关的顺式调节元件(ARE) 存在于32 个PeLACs的启动子中；与干旱相关的MYB 转录因子结合元件(MBS) 以及低温响应顺式作用元件(LTR)分别存在于30 个和24 个PeLACs 的启动子中；还有低氧特异增强元件(GC-motif)、防卫和胁迫响应元件(TC-rich repeats)，但TC-rich repeats 的数量最少，仅存在于10 个PeLACs 的启动子中，每个启动子中仅有1 个(图1)。

与前2 类相比，与生长发育过程相关的顺式作用元件的种类和数量均相对较少。其中参与分生组织生长的CAT-box 最多，存在于27 个PeLACs 的启动子中，而与胚乳发育及种子发育相关的顺式作用元件O2-site 和RY-element 分别存在于13 个和14 个PeLACs 的启动子中，GCN4_ motif最少仅存在于7 个PeLACs 的启动子中(图1)。

图1 PeLACs 启动子中与激素响应、环境胁迫及发育相关的顺式作用元件Fig.1 The cis-acting elements related to hormone response，environmental stress and development in the promoters of PeLACs

另外，在PeLACs 的启动子中还存在大量的光响应相关的顺式作用元件，其中最多的是G-box，其次是Box 4。这些结果表明，PeLACs 的表达受到多种植物激素和逆境胁迫的影响，启动子可能通过对不同植物激素和逆境胁迫做出应答，来调节基因的表达，进而使毛竹适应相应的生长环境。

2.2 不同处理下PeLACs 的表达分析

在不同漆酶基因启动子中不同顺式作用元件的存在，表明它们可能对不同激素以及非生物胁迫具有不同的响应机制。因此，利用转录组数据进行了不同处理条件下42 个基因PeLACs的表达模式分析。结果表明，经过GA3处理4 h后，14 个PeLACs 显著变化，其中11 个PeLACs下调和3 个PeLACs 上调，其余基因的变化均未超过2 倍(图2A)，变化不显著。在低温和干旱处理的毛竹叶片中，能检测到大部分PeLACs的表达，但有12 个PeLACs (低温) 和14 个PeLACs (干旱) 检测不到表达(FPKM ＝0) 或几乎不表达(FPKM<1) (图2B，C)。与处理前相比(0 h)，随着低温胁迫时间的延长，6 个PeLACs 表达持续上调，而其余基因则呈现持续下调或先升高后下降的趋势(图2B)，在干旱胁迫下检测到表达的基因也表现出相似趋势(图2C)。在GA3处理以及低温和干旱胁迫下PeLACs 的表达差异表明，它们在应对激素和非生物胁迫过程中可能发挥着重要的作用。

图2 不同处理条件下毛竹中PeLACs 的表达模式Fig.2 Expression profiles of PeLACs in moso bamboo under different treatments

2.3 不同长度根和不同高度笋中PeLACs 的表达分析

漆酶是木质素生物合成单体聚合的关键酶，在竹子木质化中发挥着重要作用。为此，对毛竹不同高度笋中的PeLACs 表达进行了分析。结果表明，在不同生长阶段的根和笋中PeLACs 的表达模式存在着一定的差异，其中16 个PeLACs 在根和笋中表达水平较高且存在类似的变化趋势。随着根长的增加(根生长)，表达量上调，具体表现为2 种变化模式，即持续上调和先升高后下降(图3)。另外，这些基因在笋中表达也表现出相似的变化趋势，即随着笋高度的增加，它们的表达量呈现上调的趋势，同样也存在2 种变化模式。有趣的是，这些基因在0.2 m 笋中不表达或者表达量极低；在1.5 m 和3.0 m 高度笋中的中部和基部高表达，但在尖部表达量极低；但是在6.7 m 笋则尖部和中部的表达水平高，而基部反而较低。这些PeLACs 表达的变化与竹笋、根的木质化过程的变化趋势高度吻合，说明这些基因参与到笋和根的木质化过程[16]。

图3 PeLACs 在毛竹根和笋中的表达Fig.3 Expression of PeLACs in roots and shoots of moso bamboo

2.4 PeLAC20 启动子克隆与瞬时表达构建

用引物LAC-pro-F 与LAC-pro-R 进行扩增，琼脂糖凝胶电泳结果表明，获得了约2.0 kb 的特异条带(图4A)，连接到pGEM T-easy 载体后测序结果表明，插入片段为2 000 bp。用引物LAC410-pro-F1 与LAC410-pro-R1 进行扩增，获得了约2.0 kb 的特异条带，测序结果表明，包含PeLAC20上游PeLACp序列2 000 bp 以及添加的XbaⅠ(tctaga) 和BamHⅠ(ggatcc) 酶切位点序列 (共计12 bp)，将目的片段与载体pBI101 进行连接，得到PeLACp与GUS融合的表达载体(图4B)，经XbaⅠ和BamHⅠ双酶切后验证(图4C) 和测序后，证明获得了正确的瞬时表达载体。

图4 启动子PeLACp 克隆与瞬时表达构建Fig.4 The promoter isolation of PeLACp and its transient expression vector construction

2.5 PeLAC20 启动子在拟南芥中瞬时表达

转化拟南芥，经Kan 抗性筛选获得了转基因植株。进行GUS 染色分析，结果显示PeLACp∶∶GUS转基因植株的根部和子叶缘处被染成蓝色，且根的染色较深(图5A)，而野生型拟南芥没有染上蓝色(图5B)。由此表明，PeLACp具有启动子活性，而且该基因的表达在不同组织中存在一定的差异，这可能与该基因的功能密切相关。如在木质化程度较高的根部表达，可能与PeLAC20参与木质素的合成有关。

3 讨论

基因表达由启动转录的启动子和控制其时间和空间活动的增强子调节[23]。基因转录的精确和准确调节主要取决于启动子，它们在基因组内和基因组之间变化很大，一些启动子富含特定类型的碱基，而其他启动子则具有更多样、复杂的序列特征[24]。启动子的特性最初是通过能增加或降低基因转录速率的突变而鉴定的。启动子一般位于转录起始位点的上游，被RNA 聚合酶识别并结合后，开始影响基因的转录，进而影响基因的功能。漆酶基因是竹子木质素生物合成中木质素单体聚合的关键基因，对木质素的沉积具有重要作用[17]，也是影响细胞壁组分的重要因素，进而影响竹材材性。本研究全面分析了42 个PeLACs 的启动子序列，发现其中含有多种与激素以及非生物胁迫相关的顺式作用元件，在不同处理下的毛竹转录组数据中漆酶基因的表达模式进一步证明了PeLACs 的表达受到GA3处理、低温和干旱胁迫等的影响，同时也表明各漆酶基因在功能上存在一定的差异。

目前从分子水平对漆酶的研究已逐渐成为热点，并进入基因工程阶段，如在过量表达棉花GaLAC1的新疆杨转基因植株中总木质素含量增加[25]、敲除美洲黑杨的漆酶基因导致细胞壁化学改变及糖释放增加[26]。本研究中PeLACs 在不同长度根和不同高度笋中的表达模式，表明PeLACs与毛竹木质化中发挥着重要作用，为竹子基因工程后续基因的选择提供了参考。同时，很多重要的漆酶基因被克隆并采用重组技术研究其同源表达、异源表达及调控机制[27]。合成启动子对于基于基因工程的作物改良策略至关重要，利用源自繁缕(Stellaria mediaVill.) pro-SmAMP1 和pro-SmAMP2 启动子，合成的一种新的合成启动子，在瞬时表达和转基因细胞选择方面都具有高效性[28]。然而，从漆酶基因启动子入手研究其功能却鲜有报道，本研究通过瞬时表达，表明基因启动子主要在根中表达，该基因具有组织表达特异性，对于进一步开发漆酶基因特异表达启动子具有重要参考价值。但是，竹子分子生物学研究整体起步较晚，尚有更多的研究工作需要深入开展。