基于ISSR标记的丁香属植物亲缘关系分析

姚瑞红，魏 杰，孟 昕，金梦然，刘雅兰，寇紫倩，史宝胜

（河北农业大学 园林与旅游学院,河北 保定 071000）

丁香属植物树形优美、花期长是城市园林绿化的主要树种。木犀科（Oleaceae）丁香属（SyringaSpp.）植物主要分布在亚洲温带地区及欧洲东南部[1]。我国丁香属植物约有32种，自西南至东北各地都有[2]。美国、英国、加拿大、德国、俄罗斯等国家普遍引种欧丁香，并成功选育出1 800多个品种。随着丁香新品种的快速增长，品种混乱、命名不规范、种系定位不一、亲本来源不明等问题接踵出现，阻碍了丁香产业的发展。

林奈建立丁香属，并将其归为木犀科，这种划分方式很少有争议，但是对丁香属的属下分类等级问题，学者们观点不一。Rehder[3]和 Fiala[4]认为丁香属应分为2个亚属。而张美珍[5]将丁香分为2组4系，包括短花冠组和长花冠组，长花冠组可分为欧丁香系、羽叶丁香系、巧玲花系、顶生花序系，但该分类方法弱化了顶生花序类和侧生花序类的区别，划分存在缺陷，对许多起源不明确或具有多亲本品种的分类鉴定具有局限性。

近年来，ISSR技术被广泛应用于包括植物在内的不同生物的遗传多样性研究[6-7]。目前，ISSR分子标记技术已广泛应用与樱属[7]、兰属[9]等多种植物的亲缘关系及遗传多样性的研究。针对不同品种丁香属植物的分子标记研究较少，Yang[10]利用EST-SSR标记对紫丁香群体的遗传多样性进行了分析，鉴定出17个与花性状相关的SSR标记。思彬彬[11]从100 条ISSR引物中筛选出3条引物可以扩增出多态性特征条带，用于鉴别白花和紫花丁香。陈秋月[12]用11条ISSR引物对野生和栽培紫丁香种群的遗传多样性进行了研究，野生种群比栽培种群表现出较高的遗传多样性。ISSR作为一种更高效、更多态性的分子标记，广泛应用于鉴别植物亲缘关系。本研究利用ISSR分子技术对40个丁香品种亲缘关系进行分析，构建DNA指纹图谱，以期从分子水平阐述其亲缘关系，实现鉴别不同丁香种（品种）目的，了解丁香品种的遗传背景，为丁香品种鉴定、品种分类及杂交育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

40份植物材料于2020年9月从河北农业大学试验基地和北京植物园采集。选择生长健壮、无病虫害的植物幼嫩叶片，用锡箔纸装置于液氮桶中，放置在实验室-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA提取 利用改良CTAB法[13-14]提取40份丁香属植物材料总DNA。根据康为世纪试剂盒说明书提取总DNA。

1.2.2 基因组DNA检测方法 用Nano Drop 2000检测提取DNA浓度和纯度[15]，采用琼脂糖凝胶电泳法检测不同方法提取的DNA的完整性[16]。

1.2.3 ISSR-PCR反应体系设计 初筛引物：利用哥伦比亚大学和杨晓霞等[17-19]公布的32条引物在表型差异明显的裂叶丁香、喜马拉雅丁香、暴马丁香3种植物中进行初步筛选，选出扩增产物主带明显，条带清晰的引物。ISSR-PCR反应体系：在25 μL的反应体系中，DNA(40 ng/μL)模板 1 μL，引物(10 μmol/L) 2 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，ddH2O 补足。扩增反应程序为：94 ℃ 预变性 5 min；94 ℃ 变性 45 s，退火 45 s，72 ℃ 延伸 90 s，30 个循环；最后 72 ℃保持 7 min，4 ℃保存。

DNA模板和循环数的优化：用ddH2O将裂叶丁香、喜马拉雅丁香、暴马丁香DNA浓度分别稀释到 10、20、40、60、80、100 ng/μL，作为 ISSRPCR的模板。

选择20 ng的DNA模板，扩增反应程序同上，循环数分别设置为25、30、35、40。

退火温度优化：利用上述优化的反应体系和扩增条件，对初筛的引物，按照每个引物Tm值，设置10个不同梯度的温度进行PCR扩增。最终筛选扩增条带清晰、多态性好的引物的最佳退火温度。

1.2.4 数据分析 电泳图谱中的每1条带可代表1个引物的结合位点，采用人工读带的方法，统计数据输Excel表格，建立ISSR扩增条带0/1矩阵数据库[16]。利用POPGENE 32软件分析指标有观测等位基因数（observed number of alleles,Na）、有效等位基因数（effective number of alleles,Ne）、Nei’s遗传多样性指数（H）、Shannon’s信息指数（I）。利用 NTSYS pc 2.10e软件进行遗传相似性系数计算，使用非加权组平均法（UPGMA）绘制聚类分析图。

表1 40份丁香属材料信息Table 1 The information on 40 species of Syringa materials

2 结果与分析

2.1 基因组DNA提取与检测

采用CTAB法和试剂盒快速提取法进行DNA提取，从图可看出用CTAB法提取DNA含有较多杂带；根据试剂盒说明书提取DNA，条带清晰，无拖尾现象（图1）。选用康为世纪试剂盒提取丁香植物的总DNA。

图1 不同方法提取总DNAFig. 1 The total DNA extracted by different methods

利用DNA提取试剂盒提取40份丁香属植物材料的DNA，结果均是1条清晰的条带（图2），OD260/OD280的值介于1.8～2.0，无RNA污染、拖尾和弥散现象，利用Nano Drop 2000测得DNA的质量浓度为25～680 ng/μL。提取的DNA可以满足ISSR-PCR反应对模板DNA的质量要求。

图2 母液 DNA完整性鉴定Fig. 2 The DNA integrity identification of mother liquor

2.2 ISSR-PCR反应体系的优化

2.2.1 DNA浓度筛选 PCR扩增反应的原料是模板 DNA，用量的多少对扩增反应有着重要影响。模板DNA浓度过低时，导致扩增结果得率少；过高则会发生错配现象。本研究设置了10、20、40、60、80、100 ng/μL 6 个浓度梯度，结果如图3。从图中可以看出，模板DNA浓度为20 ng/μL时，扩增的条带清晰，无非特异性条带产生。因此，本研究ISSR-PCR扩增体系模板DNA的最适范围为20 ng/μL。

图3 不同模板浓度对扩增的影响Fig. 3 Effect of different template concentrations on amplification

2.2.2 循环数筛选 循环数对PCR结果产生影响，循环数太多，由于反应时间过长，非特异产物的扩增相应增加。由图4可知，循环数为25，扩增的条带不清晰；循环数为35时，扩增的条带清晰、分明。因此，ISSR-PCR反应体系中，设置循环数为35最合适。

注：1～3为25循环；4～6为30循环；7～9为35循环；10～12为40循环。

2.2.3 退火筛选 影响PCR扩增的一个重要条件是退火温度。温度过高导致引物与模板结合差、特异性强、多态性差、产物少；过低则导致引物与模板非特异性结合。本研究根据所筛选出引物的Tm值上下设置10个温度梯度进行PCR扩增，筛选不同引物的退火温度。各引物筛选后的最适退火温度见表2，引物UBC841退火温度的筛选结果见图5。

表2 ISSR分析的引物序列Table 2 The primers sequences of ISSR analysis

图5 UBC841退火温度筛选Fig. 5 The UBC841 annealing temperature screening

2.3 ISSR引物筛选与扩增结果

本文对32个ISSR引物进行初筛、复筛，最终确定引物退火温度，共筛选出13个扩增条带多、条带清晰、重复性好的ISSR引物，部分引物筛选结果如图6所示。40份丁香属材料共扩增出264个重复性好、条带清晰、稳定性好的位点，其中多态性位点数264个，占总位点数的100%；各引物扩增位点数在12～29之间，平均为20.31个位点。扩增结果说明，这13条引物扩增得到的条带多态性丰富，可以用于丁香属材料间亲缘关系分析。

图6 引物UBC842的PCR扩增电泳图谱Fig. 6 The PCR amplification electrophoresis map of primer UBC842

2.4 遗传多样性分析

利用POPGENE 32软件分别对40份丁香属材料的遗传多样性进行分析。结果显示：40份丁香材料观测等位基因数(Na)值均为2.000 0。有效等位基因数(Ne)最大值出现在引物ISSR2-2(1.961 5)，平均Ne值为1.187 7。平均Nei’s遗传多样性指数(H)为 0.144 0，Shannon’s信息指数 (I)为 0.260 5，均在引物 UBC840 位点出现H(0.495 4)和I(0.688 6)最大值，显示了丁香属植物DNA具有较高的多态性，有着丰富的遗传多样性。

2.5 亲缘关系分析

利用13条ISSR引物产生的标记信息，经NTSYS 2.10分析软件计算40份丁香种间遗传相似系数变化范围为0.655 3～0.950 8，见表3。其中 ‘裘利’和 ‘裘利紫花重瓣’ 遗传相似系数最大为0.950 8，说明这2个品种之间亲缘关系最近，遗传差异相对较小。‘四季蓝’‘漂移’遗传相似系数最小为0.655 3，说明两者亲缘关系最远，遗传差异相对较大。

表3 40份丁香属材料遗传相似系数Table 3The genetic similarity coefficient of 40 Syringamaterials

2.6 聚类分析

为了确定各丁香种类间的亲缘关系，采用NTSYS2.10分析软件对0/1矩阵按UPGMA进行聚类分析，构建树状聚类图（图7）。结果表明遗传相似性系数为0.742 0时，群体可分为4个类群。

图7 40 份丁香属的聚类图Fig.7 The UPGMA dendrogram for 40 Syringa materials

类群I包含的丁香最多，有紫丁香、白丁香、‘大花重瓣’欧丁香等35个丁香品种。在遗传相似系数为0.782 0时，花叶丁香和什锦丁香亲缘关系较近；‘大花重瓣’欧丁香和紫丁香聚为一类，其花型、花色表现高度相似，花期略有不同；‘罗兰紫’‘香雪’‘紫云’‘晚花紫’、朝鲜丁香和朝鲜紫丁香亲缘关系较近，其中‘罗兰紫’‘香雪’‘紫云’花瓣均为重瓣，‘罗兰紫’和‘香雪’花期差异不显著，‘晚花紫’和朝鲜丁香遗传相似度较高，花单瓣、花色均为淡紫色，以上均为欧丁香系，与传统分类一致。‘金色时光’和四川丁香聚为一类；‘裘利’‘裘利紫花重瓣’‘瓷蓝’和‘占姆士’亲缘关系近，其叶形、叶尖与叶片质地高度相似；日本丁香、匈牙利丁香、喜马拉雅丁香、红丁香聚为一类，与高洪晓[20]利用AFLP分子标记将匈牙利丁香和喜马拉雅丁香聚为一类结果相符，但与日本丁香聚为一类，可能是在育种过程中，有顶生花序的血统加入；裂叶丁香、‘沙宣’、白丁香分别单独聚为一类。遗传相似系数为0.792 0时，‘象牙段’和北京丁香、‘金园’、暴马丁香聚在一起，短花管组位于长花冠组内部，与何淼[21]研究结果一致。遗传相似系数为0.812 0时，莫斯加与辽东丁香亲缘关系较近，这表明莫斯加可能与顶生花序系亲缘关系较近。遗传相似系数在0.851 6时，‘骄傲四季’与小叶丁香、关东丁香聚在一起，与‘骄傲四季’是小叶丁香的变种结果一致，均为巧玲花系，与传统分类一致。

类群Ⅱ将‘玲珑’和‘金色小叶’聚为一类。类群Ⅲ有‘漂移’和‘天府信步’。类群Ⅳ将‘四季蓝’单独聚为一类。根据聚类分析结果，40个品种均被聚类分开，说明丁香种类间具有一定的遗传差异，ISSR标记在丁香种质资源分析和品种鉴定研究方面具有较好的效果。

2.7 指纹图谱的构建

本研究利用核心引物 UBC834 构建了 40 种丁香属植物的 DNA 指纹图谱（图8），该指纹图谱可用于40种丁香的分类与鉴定。

图8 UBC836 引物构建的 40 种丁香种质资源 DNA 指纹图谱Fig. 8 The DNA fingerprints of 40 Syringa germplasm resources constructed by UBC836 primers

3 讨论与结论

ISSR分子标记是有价值的工具，用于识别和评估物种之间的遗传多样性[22-23]。本研究从32条ISSR引物中筛选出13条引物用于丁香属植物亲缘关系分析，13条引物共扩增264条带，其中多态性条带264条，多态性位点占100%，扩增的多态性条带清晰、无拖带现象，表现出较高的遗传多样性。思彬彬[11]用3条ISSR引物来鉴别紫花与白花丁香，在陈秋月[12]、杨亚珺[19]、Yunyao Yang[10]的研究中发现，ISSR、SSR分子标记在丁香属植物中均表现出较高的遗传多样性。由此说明，ISSR分子标记技术可用于丁香属种质资源的分类、品种的鉴定。

通过研究发现各品种间遗传相似系数相差较大，丁香属植物之间遗传多样性较高。欧美对本属进行杂交育种已有近百年的历史，先后曾选育出数百个栽培品种。有些栽培品种已经无法确定其亲本和亲缘关系。本试验选取的一些丁香品种亲本不明，聚类结果表明，‘四季蓝’‘天府信步’‘漂移’‘金色小叶’没有聚在传统分类学的内部，可能是由于这些国外品种与国内丁香品种血统差距较大，亲缘关系较远，这一结果也证实了丁香属植物遗传多样性较高[24]。不同系之间的聚类结果有交叉现象，巧玲花系的小叶丁香、关东丁香聚在了顶生花序系毛叶丁香和辽东丁香的内部，可能巧玲花系和顶生花系存在较近的亲缘关系[20]。传统分类方法将丁香属植物划分为2组4系，本研究发现短花冠组聚在长花冠组内部，并且首先与巧玲花系和顶生花序系聚类，该研究与Li等[25]通过研究rDNA的ITS与ETS结果表现一致，他们认为应该去除组的划分。

DNA指纹图谱是以分子标记为基础发展起来的遗传标记方式，因具有多位点性、高变异性、简单而稳定的遗传性，已广泛应用在品种鉴定、种质资源分类等多方面[26]。崔学强[27]采用ISSR分子标记用3个引物构建DNA指纹图谱单独鉴别出22种石斛兰。陈必芹[28]利用ISSR标记，建立了44个四照花栽培品种及其亲本的指纹图谱。但未见利用ISSR分子标记建立丁香属植物指纹图谱的报道，本研究利用UBC836单独鉴别出40份丁香材料，每个材料都有一套独特的指纹图谱，为丁香属植物的鉴定提供了更高效的依据。

本研究利用ISSR分子标记技术，在分子生物学水平上揭示不同丁香材料具有丰富的遗传多样性，并对我国不同丁香属材料的亲缘关系进行了区分和鉴定，证明了ISSR分子标记法是有效和可靠精准鉴定丁香种质资源的方法，为杂交育种亲本选育提供理论依据。