基于ISSR 分子标记的茶树种质资源的遗传多样性及亲缘关系分析

张丽丽

（江西建设职业技术学院，江西南昌 330200）

茶树作为一种历史悠久的作物，通过自然培育和人工培育相结合的方式形成丰富的种类，分布范围极其广泛。由于茶树的材质特殊，可在木质雕刻中发挥良好效果，茶树叶子制作茶叶、茶树的种子也可用作榨油，具有良好的经济效益。茶树性状的控制需要依据茶树种质资源，通过科学的基因选择和融合，培育出产量高、质量好的茶树种子[1]，茶树种质资源的研究本质上是分析茶树基因，不再依靠茶树自身进化，而是采用人工的方式选取最佳基因，提升茶树产量和质量。茶树种质资源就是茶树的品种基因，在自然演化后，经由人工选择形成，作为一种极其重要的物质基础，可以此为依据创新茶树品种。茶树遗传物质存在于茶树种质资源之内[2]，根据种质资源的分析结果可知，将高质量的茶树品种及一些特殊品种的遗传物质亲子相传。茶树种质资源分析过程中[3]，分子标记技术的应用逐渐广泛，作为一种新型技术，采用PCR 技术扩增锚定的ISSR 引物内的DNA 序列，直观表达茶树的亲缘关系，并分析遗传背景的差异[4]。所以，以ISSR 分子标记作为核心，深入研究茶树种质资源，可以在培育茶树良种方面发挥较大作用，促进茶叶产业可持续发展。

1 材料与方法

1.1 材料

从4 个气候差异较大的城市共采集36 种茶树材料，将其编号为1～36 作为试验样本，进行茶树种质资源分析试验。

1.2 提取DNA

通过CTAB 改进法，提取不同茶树样本的DNA。首先需要冷冻茶树种质资源样本，为了保证材料冷冻效果在其中添加液氮。放入自动研磨仪内，并研磨冷冻后的材料。倘若茶树样本研磨得不够彻底，可以重新冷冻研磨。在研磨后的样本中滴入提取液，按照提取说明观察样本变化，并获取所有样本的DNA。针对DNA 样本检测结果，记录不同DNA 样本的浓度和纯度测试结果。根据DNA 浓度添加稀释液，使得所有样本浓度保持在20～30 ng·μ/L，并在-20℃条件下保存。

1.3 ISSR 引物的PCR 扩增

茶树样本应用ISSR 分子标记的方法形成ISSR 产物，针对每一个DNA 样本应用PCR 扩增技术。使用溴化乙锭对扩增产物染色处理，利用紫外分析仪进行检测。之后配制缓冲液，并在电泳上添加6%的聚丙烯酞胺凝胶。通过1min 的94℃变性处理，和40s 的56℃退火，保存处理后的样本，以便后续应用。

2 结果分析

2.1 ISSR 引物多态性

将原茶树样本通过PCR 扩增，形成89 条ISSR 引物，在其中选择14 对稳定性较高的扩增条带。选取的扩增条带中多态性百分比达到100%的共有8 条，并且其他引物中也包含或多或少的多态性条带，详细结果如表1 所示。

表1 ISSR 引物扩增结果

由表1 可知，14 对ISSR 引物使原始样本扩增出156 条条带，而其中仅有7 条没有呈现出多态性条带，仅占总条带的4.49%。通过上述表格分箱子可以发现，ISSR 引物扩增形成的平均多态性条带数达到10.43条，而平均多态性百分比高达95.19%。由此可见，各种茶树都存在丰富的遗传多样性。

2.2 ISSR 聚类分析

通过茶树种质资源遗传距离的分析，针对36 个材料样本，构建图1 所示的UPGMA 进化树。

图1 UPGMA 进化树

根据遗传距离可以将试验样本划分为3 部分，如图1 中显示的Group1、Group2、Group3。第1 个类群中一共包含15 个样本，其中遗传距离最近的是样本10和样本13，合理推断出样本10 和样本13 之间亲缘关系很近。第2 个类群中包含9 个样本，第3 个类群则由12 个样本组成。在后2 个类群中，一些组合的遗传距离完全相同，这种现象意味着这些茶树种质资源具有相似的背景。由UPGMA 进化树形成3 个类群，计算不同类群的分子方差，可以发现14 对ISSR 引物的分子变异程度如下所示：根据分析可知，ISSR 引物组间与组内的相似频率分别达到8%、14%，引物个体基因相似频率达到78%。在分析不同茶树样本的遗传距离差异后，可得出茶树的分子遗传或变异均是以个体为基础。应用Cervus 软件模拟不同茶树样本之间的亲缘关系，得出大部分情况下亲缘关系置信度水平超过80%，所以将亲缘关系判断阈值设置为1.00 和1.25，当2 个样本计算的LOD 值超过阈值，则表明2 个样本间存在亲缘关系。针对试验结果可知，样本35 和样本36 的亲缘关系较为明显，并且二者均与样本21 存在亲缘联系。

3 试验结果讨论

根据结论与讨论可知，选出的扩增条带显示出茶树样本的整体多态性。因此，可以成功识别文中采集的36 份茶树种质资源材料的遗传多样性及亲缘关系。

分析茶树种质资源的多态性结构，将DNA 样本的多态性展现在人们面前，并展示出不同茶树种质资源群体的变异性。依靠1SSR 分子标记方法展现了不同茶树种质资源的聚类结果，其中在相同地区采集的茶树通常聚为一类，而适制性相同的也会单独聚类。根据遗传背景分析可知，很多背景相似度不高的品种，由于遗传相似性显示出亲缘关系。

茶树种质资源间的亲缘关系取决于遗传背景。遗传距离往往随着遗传背景的接近而减小，则表明这2 株茶树存在较近的亲缘关系，同时具有较为相似的遗传相似背景。分析试验中使用的36 种茶树样本，计算出不同茶树之间具有0.35～0.95 的相似系数，并且平均相似系数为0.74。这代表不同茶树种质资源之间遗传背景差别较大，亲缘关系的远近也有很大差别，并显示出了较强的遗传多样性。但根据UPGMA 进化树的分析可知，绝大部分茶树样本的遗传距离都高于0.7，这显示了大部分茶树拥有较近的亲缘关系，显示了茶树群体的遗传多样性。根据试验结果可知，明确不同品种茶树之间遗传信息的差别主要是由于地理隔离。因为不同地理区域内，气候条件差别较大，使得在相同区域内的茶树会频繁交换基因。由于区域环境的限制，相隔较远的茶树难以多次交换基因，最终造成了茶树群体具有丰富的遗传多样性，同时很多茶树之间具有一定的亲缘关系。

4 结语

以茶树种质资源样本进行试验，研究茶树亲缘关系，并分析出不同茶树的遗传多样性，在完成PCR 扩增后可筛选出稳定性较高的引物，引物表现出了茶树具有极高的平均多态性，分析划分类群后的样本完成亲缘关系。研究结果显示，多数茶树品种之间的遗传背景差异较大。在茶树发展过程中，遗传多样性、亲缘关系的分析，为茶树育种提供了支撑，通过茶树样本基因型的分析，将结果应用于茶树杂交培养中，提升优秀茶树品种的概率，推动了未来茶树新品种选育及种质资源保存。