两株水源性铜绿假单胞菌的分离与鉴定

◎ 梁涛波，龙 慧，占忠旭，莫 逆，陈 波，于 帆，吴 鑫

（1.江西省食品检验检测研究院，江西 南昌 330001；2.南昌市疾病预防控制中心，江西 南昌 330038；3.江西润田实业股份有限公司，江西 南昌 330029）

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA），又称绿脓杆菌，是一种革兰氏阴性无芽孢棒状杆菌，属于假单胞菌属，细菌的大小约为（0.4～0.9）μm×（1.4～3.0）μm[1-2]。铜绿假单胞菌分布广泛，在水源、土壤、空气等自然环境中均能分离[3-5]，而且在人类及一些哺乳动物的呼吸道、肠道、以及皮肤等器官表面也有分布[6-8]。在众多的临床病例中发现，铜绿假单胞菌是一种感染风险高、感染部位广、危害严重的条件致病菌，可引起患者严重感染，包括败血症、肺炎、心内膜炎、中耳炎和角膜炎等[9-11]，并且具有产生多种毒素（溶血毒素）、形成生物膜、耐多种抗生素等生物特性[12-14]。根据国家相关法规和标准，铜绿假单胞菌是自来水和桶装水中质量安全检测最常见识别的细菌之一，并且在国家及省级食品药品监督管理部门的抽检报道中发现，在2014—2018年有2 350批次的桶装水样品中发现了铜绿假单胞菌[15]。随着人民生活水平的提高，桶装水进入了全民饮用，其中包括婴儿和老人，他们的免疫系统不稳定，而且还包括免疫力低下的病人[16-17]。因此，瓶装水必须符合国家法规和标准规定的卫生要求，从而确保其质量和饮用安全。

本研究根据抽检任务，对桶装水样本按照《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》（GB 8538—2016）中铜绿假单胞菌检测方法进行分离鉴定，获取了两株产绿脓菌素的铜绿假单胞菌，针对两株水源性铜绿假单胞菌分离株，进行了生化鉴定、药敏分析、毒力基因检测以及16s DNA测序同源比对分析。本研究对监控和预防桶装水铜绿假单胞菌污染提供了参考，为桶装水生产环节预防和控制桶装水污染铜绿假单胞菌提供科学依据，对桶装水微生物安全具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 培养基

营养琼脂、CN琼脂平板、绿脓菌素测定培养基、乙酰胺肉汤培养基，均购自北京陆桥技术股份有限公司。

1.2 生化鉴定和药敏纸片

VITEK革兰氏阴性细菌鉴定卡，革兰氏阴性菌药敏卡片（AST-GN16），购自法国梅里埃公司。

1.3 引物

表1 为本实验设计的引物序列。

表1 引物序列表

根据美国国家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）报道的铜绿假单胞菌毒力基因和溶血基因核酸序列，使用Primer primer 5软件设计引物，并通过BLAST验证引物的特异性。

1.4 方法

1.4.1 细菌的分离培养

根据GB 8538—2016中规定的铜绿假单胞菌检验方法，对桶装水样本进行检测。通过孔径半径为0.45 μm滤膜过滤250 mL水，然后将滤膜放置在CN琼脂上，在36 ℃恒温培养48 h后，挑取疑似铜绿假单胞菌的菌株划线接种在营养琼脂表面进行培养。将获取的单菌落分别接种在CN琼脂上、乙酰胺肉汤培养基、绿脓菌素测定培养基，在36 ℃培养1～5 d后，对细菌的生长特点进行观察记录。

1.4.2 细菌染色镜检

取分离鉴定纯培养获得的铜绿假单胞菌培养液，挑取一环置于洁净的玻璃片上并进行涂片，然后通过酒精灯干燥，滴入结晶紫进行初染并使用蒸馏水冲洗，再滴入一滴碘液媒染并使用蒸馏水冲洗，接着加入95%酒精进行脱色，再滴入一滴番红复染并使用蒸馏水冲洗，最后通过普通光学显微镜镜检，观察铜绿假单胞菌的菌落形态。

1.4.3 细菌的生化鉴定和药敏试验

取分离鉴定纯培养获得的铜绿假单胞菌培养液，制备细菌悬液使其浓度在0.5～0.6麦氏单位，使用VITEK 2 Compact全自动细菌生化鉴定系统与革兰氏阴性细菌鉴定卡、细菌药敏分析系统与革兰氏阴性菌药敏卡片（AST-GN16）进行测定分析。

1.4.4 细菌基因组DNA的提取

取分离鉴定纯培养获得的铜绿假单胞菌培养液1 mL，加入1.5 mL离心管中，在12 000 r·min-1离心3 min，去除上清液，然后加入1 mL超纯水重悬，在12 000 r·min-1离心3 min，去除上清液，重复操作一次，最后重悬在200 μL超纯水中[18]。准备100 ℃沸水，将制备好的菌悬液放入其中煮沸15 min，然后放在冰水浴中5 min，最后在12 000 r·min-1离心3 min，取上清液，为细菌基因组DNA，储存在-20 ℃待用。

1.4.5 毒力基因和溶血基因的检测

qPCR反 应 体 系15 μL：2×TSINGKE Master qPCR Mix 7.5 μL、DNA template 2 μL、primer 1.5 μL、ddH2O 4 μL；qPCR反应程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，40个循环，72 ℃采集荧光信号，最后72 ℃充分延伸5 min。

1.4.6 16s rRNA测序

将分离纯化的铜绿假单胞菌液，送往上海生工生物工程有限公司（Sangon Biotech）进行16s rRNA测序，并将测序结果利用NCBI BLAST进行核酸序列比对，并使用Mega X软件进行同源性分析。

2 结果与分析

2.1 菌落培养特性及形状观察

CN琼脂平板划线培养结果显示，PA-0659、PA-0661两株细菌生长态势良好、菌落饱满、并且菌落呈现浅绿色，通过紫外照射发现有荧光显示，结果见图1。根据绿脓菌素测定培养基细菌培养的结果，加入三氯甲烷和盐酸，发现上层盐酸溶液中出现粉色，说明两株铜绿假单胞菌分离菌均能产生绿脓菌素，结果见图2。在乙酰胺肉汤中36 ℃培养24 h后，加入1～2滴纳氏试剂，发现颜色从深黄色变为砖红色，说明分离的两株铜绿假单胞菌分离菌均能产氨，结果见图3。通过对纯培养的两株铜绿假单胞菌分离菌进行革兰氏染色以及普通光学显微镜镜检可以发现，两株细菌形态为长棒状、大小约为（0.5～0.8） μm×（1.5～1.8） μm，革兰氏染色结果显示为革兰氏阴性，结果见图4。

图1 CN琼脂平板划线培养形态图

图2 绿脓菌素测定结果图

图3 产氨实验图

图4 革兰氏染色镜检图（油镜100×）

2.2 生化分析结果

根据VITEK 2 Compact全自动生化分析结果，发现两株分离菌PA-0659和PA-0661均能分解D-葡萄糖、D-甘露醇、D-甘露糖、D-海藻糖、柠檬酸盐（钠）、丙二酸盐、乳酸盐和琥珀酸盐，且COURMARATE酶、γ-谷氨酰转移酶、β-丙氨酸芳胺酶、L-脯氨酸芳胺酶和酪氨酸芳胺酶均为阳性；两株分离株均不分解蔗糖、侧金盏花醇、D-塔格糖、L-阿拉伯醇、D-纤维二糖、5-酮-葡萄糖苷、α-葡萄糖、D-麦芽糖、古老糖和D-山梨醇，且N-乙酰-β-半乳糖氨酶、α-半乳糖苷酶、磷酸酶、氨基乙酸芳胺酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、β-葡萄糖苷酶、β-木糖苷酶、β-葡萄糖苷酸酶和谷氨酸-甘氨酸-精氨酸芳胺酶均为阴性。生化分析结果表明两株分离株PA-0659和PA-0661均为铜绿假单胞菌，而且两株分离株在生化分析中存在一些差异，PA-0659脂酶阳性，PA-0661谷氨酰芳胺酶和尿素酶阳性，详细结果见表2。

表2 生化鉴定结果表

（续表2）

2.3 耐药分析结果

两株分离株PA-0659和PA-0661均能耐受阿莫西林-棒酸、氨苄西林、头孢匹美、头孢西丁、头孢曲松、厄他培南、呋喃妥因和哌拉西林-他唑巴坦等药物；对氨曲南、超广谱β-内酰胺酶、复方新诺明等药物敏感，对阿米卡星、环丙沙星、庆大霉素、亚氨培南、左旋氧氟沙星和妥布霉素等药物中介，并且PA-0659分离株对药物头孢唑啉和替加环素耐受，具体结果见表3。

表3 耐药分析结果表（单位：μg·mL-1）

2.4 毒力基因和溶血基因检测结果

经过qPCR扩增目标基因，结果显示分离株PA-0659含有毒力基因toxA、ExoT、ExoY、ExoU、ExoS以及溶血基因SOB；分离株PA-0661含有毒力基因toxA、ExoT、ExoY以及溶血基因SOB，具体结果见表1。

2.5 同源性分析结果

两株分离株PA-0659和PA-0661的16s rRNA序列与NCBI报道的铜绿假单胞菌序列进行同源性比对发现，PA-0659和PA-0661与目前报道的铜绿假单胞菌具有高同源性，这进一步说明两株分离株为铜绿假单胞菌，具体结果见图5。

图5 16s rRNA进化树分析图

3 结论与讨论

本研究依据GB 8538—2016中规定的方法，对两批桶装水样本中的铜绿假单胞菌进行检测，通过一系列的分离鉴定，获取了两株水源性产绿脓菌素铜绿假单胞菌。通过对两株铜绿假单胞菌分离株的进一步研究发现，PA-0659和PA-0661均能分解D-葡萄糖、D-甘露醇、D-甘露糖、D-海藻糖、柠檬酸盐（钠）、丙二酸盐、乳酸盐和琥珀酸盐，COURMARATE酶、γ-谷氨酰转移酶、β-丙氨酸芳胺酶、L-脯氨酸芳胺酶和酪氨酸芳胺酶阳性，而且两株铜绿假单胞菌的生化存在差异，PA-0659脂酶阳性，PA-0661谷氨酰芳胺酶和尿素酶阳性；耐药结果表明两株PA分离株对阿莫西林-棒酸、氨苄西林、头孢匹美、头孢西丁、头孢曲松、厄他培南、呋喃妥因和哌拉西林-他唑巴坦等8种抗生素耐受，而且PA-0659分离株对药物头孢唑啉和替加环素耐受。毒力基因和溶血基因检测结果显示，PA-0659分离株含有toxA、ExoT、ExoY、ExoU、ExoS毒力基因及溶血基因SOB，PA-0661分离株含有toxA、ExoT、ExoY毒力基因及溶血基因SOB。16s rRNA同源性分析结果显示，两株分离株均与目前NCBI报道的铜绿假单胞菌具有较高的同源性，进一步说明两株分离株为铜绿假单胞菌。

铜绿假单胞菌的Ⅲ型分泌系统[19-21]（Type Ⅲsecretion system，T3SS）是影响宿主被急性感染的重要因素，根据检测结果分离株PA-0659的T3SS 4种包外毒力蛋白酶（包外酶T、Y、U、S）基因均为阳性，分离株PA-0661包外毒力蛋白酶基因仅有ExoT、ExoY被检出，初步说明两株分离株在急性感染宿主能力上有一定的差异。通过分析两株分离株耐药情况，可以发现PA-0659相比于PA-0661具有较强的耐药性，主要区别体现在PA-0659对头孢唑林和替加环素耐药。根据NCCLS[22]提供的铜绿假单胞菌ATCC 27853耐药信息，比较发现本研究分离的两株PA表现出更强的耐药，尤其对青霉素类、四代头孢类和硝基呋喃类等抗生素，这进一步说明两株分离株有可能在自然环境中发生了变异，使其具备更强耐药性。

通过比较两株分离株在生化、耐药、毒力基因以及16s rRNA同源性，发现两株分离株均存在一定的差异，说明两株分离株的来源、生存环境，甚至基因组信息均不同，查询两批桶装水样品信息发现，两批水样品来自不同地区的厂家。

铜绿假单胞菌是一种常见的食源性致病菌，广泛的分布在自然环境中，是大桶桶装水主要的微生物污染源。根据最新的2020年中国食品安全抽检汇总结果，全年共有848批次包装饮用水中铜绿假单胞菌不合格，其中湖南、广东和江西检出最多，分别为139批次、123批次和102批次，可见包装饮用水中铜绿假单胞菌的污染情况不容忽视。研究包装饮用水中铜绿假单胞菌生化特征、耐药信息、毒力基因以及16s rRNA同源性分析，为桶装水微生物污染的预防和控制提供科学依据，保障包装饮用水的安全。