超声波结合热处理对莲藕多酚氧化酶和过氧化物酶钝化效果研究

代雨杉，马秀菊，毕秀芳

（1.西华大学 食品与生物工程学院，成都 610039；2.四川省食品生物技术高校重点实验室，成都 610039）

0 引言

莲藕（Nelumbo nucifera Gaertn.）属睡莲科植物，是一种多年生大型水生草本植物。莲藕中富含钾、铁、硫胺素、核黄素、吡哆醇、维生素C、多酚等营养素，具有促进血液循环、消化吸收，健脾开胃，提高免疫功能以及缓解焦虑、头痛和血压等功效［1］。鲜切莲藕是将新鲜莲藕经过最少加工程序制成的一种可直接烹调食用的产品［2］，因其方便、快捷而受到人们欢迎。但新鲜莲藕加工过程中易发生酶促褐变反应，给莲藕产品的外观和营养等各方面造成极大的损害［3］。因此，开发鲜切莲藕防褐变保鲜技术已成为鲜切莲藕研究的热点之一。多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）是鲜切莲藕中发生酶促褐变的关键性酶之一，PPO在有氧条件下催化酚类物质氧化成醌，并聚合形成黑色素或褐色素［4］。此外，引起鲜切果蔬酶促褐变的重要因素还有过氧化物酶（Peroxidase，POD）［5］。

传统的热处理虽然能杀菌和钝酶，但会破坏食品的天然成分和营养物质［6］。超声波（Ultrasound，US）在食品的保鲜［7］、解冻［8］、功能性物质的提取以及食品污染物的降解中发挥了良好的作用［9-10］。超声波在食品加工中主要作用是杀菌和钝酶，周新丽等［11］发现用超声波辅热联合抗坏血酸的方法处理胡萝卜不仅能显著提高胡萝卜样品中维生素C的含量，还能最大程度地维持胡萝卜细胞的原有结构；杨明冠等［12］以600 W的超声波功率处理马铃薯90 min，发现马铃薯PPO的酶活力仅为原酶液的54.21%，结果表明超声波有效抑制了马铃薯的褐变；吴咏等［13］研究发现在超声功率密度70 W/L、双频超声20 kHz与40 kHz顺序工作15 min后，莲藕中PPO和POD的酶活力分别降低至30.6%和44.3%。但目前关于超声波结合热处理对莲藕酶活性的钝化效果鲜有报道。本试验通过研究不同温度和US单独处理以及两者结合处理对莲藕PPO和POD活力的影响，从而更好地控制酶促褐变，为工业化生产过程中莲藕品质控制提供条件和依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜莲藕，成都市红光镇世纪百盛超市；邻苯二酚、愈创木酚、双氧水、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠分析纯，成都科龙化工试剂厂；聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），Sigma-Aldrich（中国上海）。

WFJ7200型分光光度计（尤尼柯（上海）仪器有限公司）；THERMO型高速冷冻离心机（成都世纪方舟科技有限公司）；Scientz-llD型超声波细胞粉碎机（上海试验仪器有限公司）；DZKW-C型双列六孔恒温水浴箱（天津市莱悦纳格试验室仪器销售有限公司）；HBL-P08D1R型打浆机（青岛海尔成套家具服务有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 粗酶液的提取

参照王秋成等［2］的方法，并略加修改。将188 g新鲜莲藕洗净，去皮，切成5 cm×5 cm×5 cm小块，加入到470 mL，pH值为7.0，0.2 mol/L的磷酸缓冲液（含5%PVPP）的提取液中匀浆后置于4 ℃冰箱里静置12 h，再在4 ℃、8 000 r/min离心作用10 min，取上清液过滤后得到粗酶液，记录上清液体积，所得粗提物无需进一步纯化即可使用。

1.2.2 试验设计

1.2.2.1 不同温度处理酶液

取30 mL粗酶液置于50 mL烧杯中，置于水浴锅中保温，当酶液中心温度达到指定温度后开始计时，在 35～65 ℃下保温 5～30 min，在 75 ℃下保温5～10 min。达到处理时间后取出样品并迅速用25 ℃水浴降温至室温，以未处理粗酶液作对照，考察温度对粗酶液酶活力的影响，试验重复2次。

1.2.2.2 0 ℃和25 ℃下不同超声功率处理酶液

取30 mL粗酶液置于50 mL烧杯中，分别在温度为0 ℃（冰浴）和25 ℃（水浴）下，用130～520 W超声波（探头直径6 mm；探头浸入液面的高度1.5 cm；脉冲间隔2.5 s开，2.5 s关）分别处理 2，4，6，8，10 min，以未处理粗酶液作对照，分别考察0 ℃和25 ℃温度下不同功率的超声波处理对粗酶液酶活力的影响，试验重复2次。

1.2.2.3 260 W超声波结合不同温度处理酶液

取30 mL粗酶液置于50 mL烧杯中，在不同温度（25，35，45 ℃）水浴下结合 260 W 超声波（探头直径6 mm；探头浸入液面的高度1.5 cm；脉冲间隔 2.5 s开，2.5 s关）处理 2，4，6，8，10 min，以未处理粗酶液作对照，考察超声波结合不同温度对粗酶液酶活力的影响，试验重复2次。

1.2.3 指标测定

1.2.3.1 PPO的测定

参照胡婉峰等［14］的方法，并略加修改。取3 mL的底物溶液（0.3 mol/L邻苯二酚，用0.2 mol/L的磷酸缓冲液配置，pH值为7.0）与0.5 mL粗酶液迅速混合均匀后立即测定在420 nm处的吸光值，每5 s记录1次，连续记录 1.5 min。

1.2.3.2 POD的测定

参照李忠光等［15］的方法，并略加修改。取2 mL 1%的愈创木酚（0.2 mol/L磷酸缓冲液配置，pH值为7.0），0.1 mL 2%过氧化氢溶液（用0.2 mol/L磷酸缓冲液配置，pH值为7.0），然后加入0.1 mL粗酶液迅速混合均匀后立即测定在470 nm处的吸光值，每 10 s 记录1次，连续记录3 min。

PPO 和 POD的一个酶活力单位（U）定义为每分钟吸光值增加0.1。并利用如下公式计算残留酶活力（Residual enzyme activity，RA）：

式中At——处理后样品酶活力；

A0——未处理样品初始酶活力。

1.3 数据处理

用SPSS 22对数据进行显著性分析，显著水平为0.05，使用 Originpro 8.5软件作图，所有试验重复2次。

2 结果与分析

2.1 不同温度对PPO和POD活力的影响

由图1可知，当处理温度为35 ℃和45 ℃时，随处理时间的延长，PPO和POD残留酶活力无显著变化（P>0.05），与阙瑞琦等［16］发现莲藕POD在30～50 ℃稳定性较强的试验结果相似。在45 ℃下处理20 min时，出现PPO和POD活力小幅度增加的现象，这可能是因为温度升高改变了酶蛋白结构，使酶活性中心暴露，从而提高了酶活力［17］。在55 ℃和65 ℃条件下，PPO和POD残留活力随处理时间的延长显著下降，处理30 min后PPO活力分别降至52.9%、25.7%，POD活力分别降至56.7%、28.7%。朱路英等［18］也发现随着温度升高，库尔勒梨PPO活力降低，在70～75 ℃下热处理10 min，库尔勒梨PPO残留酶活力降至24.81%～35.79%。

图1 不同温度对莲藕PPO和POD活力的影响Fig.1 Effects of different temperatures on PPO and POD activity of lotus root

处理温度升高至75 ℃，PPO和POD在10 min内完全失活。张琥等［19］发现100 ℃处理10 min，马铃薯PPO残留活力降至20%；刘军伟等［20］发现90 ℃处理20 min时，紫薯PPO残留活力为10%。以上结果表明莲藕PPO和POD的热稳定性相对较差，对热更为敏感。高温钝化酶活的主要原因是高温下酶分子的二级结构中发生着α-螺旋向β-转角的转化，当升高处理温度时，α-螺旋同时向β-转角和无规则卷曲转化，从而使得酶失活速度加快。

2.2 0 ℃下不同功率US对PPO和POD活力的影响

由图2（a）可知，当超声波功率为130 W和260 W时，随着超声时间的延长，PPO残留酶活力缓慢下降，处理10 min后分别降至91.3%、80.6%；当处理时间相同时，随着超声功率的增加，酶活力下降显著，处理10 min时，390 W和520W下PPO活力分别为60.2%和41.3%。结果表明在一定时间范围内，超声波功率越高，钝酶效果越好。这与文献报道的随着超声波功率的增大，过氧化氢酶、ATP酶活力下降的结果相似［21-22］。超声波处理钝化酶的原因可能是粗酶液中的自由水在超声波的空化作用下产生自由基，迫使酶空间构象发生改变，从而发生酶活的变化。

由图2（b）可知，130 W超声波处理10 min后POD活力降幅较小，残留活力为91.3%；提高超声波功率至260～520 W，POD活力随着处理时间的延长（2～6 min）先迅速降低后几乎不变。这可以归因于POD存在2种不同热稳定性的同工酶，随着超声波处理时间的增加，不稳定型同工酶在超声波产生的高温条件下失活，而稳定型同工酶被保留［23］。在 260，390，520 W 三种功率下处理6 min，POD活力分别降至82.8%、80.6%、69.9%，这是由于超声强度越大，产生的瞬态空化作用越强，酶活力越低。

图2 0 ℃下超声波对莲藕PPO 和POD活力的影响Fig.2 Effects of ultrasound treatment on PPO and POD activity of lotus root at 0 ℃

130 W超声波处理下，PPO和POD均出现酶活力增大的现象，FONTELES等［24］也发现哈密瓜汁在373 W的超声功率下处理6 min，POD活力增加了27.4%。这可能是由于超声波产生的机械传质作用和热效应增加了底物分子与酶分子的能量，使得它们相互间碰撞的概率增大，同时也加强了介质与酶之间的传质扩散过程，从而提高了酶促反应速度。试验中超声波对酶的钝化效果有限，可能是超声波空化作用较小，还有可能是因为冰水浴抑制了超声波的空化作用［25］。

由于0 ℃抑制了超声波的作用，此时2种酶的残留活力下降是超声波产生的物理化学效应所造成的，所以试验选取温度结合超声波处理进一步探究超声波的钝酶效果。

2.3 25 ℃下不同功率US对PPO和POD活力的影响

由图3（a）可知，在130 W功率下处理4 min，PPO残留活力发生小幅度增加，随处理时间延长至10 min，PPO活力缓慢降低至79.9%。提高超声波功率至260～520 W，PPO活力随着处理时间的增加先迅速下降后缓慢降低，处理10 min时，PPO活力分别下降至69.9%、51.6%、29.6%，这与王文宗等［26］所报道的随着超声处理时间的增加，PPO活力降幅变小的变化规律相似。这可能是因为超声波产生的自由基和空化效应使PPO的构象产生了变化，使其活力在短时间内迅速降低，但由于酶的结构具有柔性，继续延长超声处理时间不会对其结构再有太大影响。

由图 3（b）可知，在 130，260，390 W 功率下处理2 min，POD活力分别增加了5.7%、0.8%、8.7%。随着处理时间延长（2～10 min），残留活力逐渐下降，处理10 min时POD活力分别降低至76.3%、69.9%、47.9%；在520 W功率下，随着处理时间延长至10min，POD活力逐渐下降至35.5%。郑炯等［27］也发现随着超声波功率的提高（100～300 W），在相同处理时间内西瓜汁POD残留活力显著降低。

图3 25 ℃下不同功率US对莲藕PPO和POD活力的影响Fig.3 Effects of different US on PPO and POD activity of lotus root under 25 ℃

图3中出现酶活力增大的现象可能是因为短时间或低功率的US作用对酶有一定的提取作用［28］，还可能是因为短时间的超声波作用会打破大分子结构，增加酶蛋白活性基团与底物结合的几率，从而提升酶活力。在相同处理时间内，对比0 ℃和25 ℃下相同功率超声处理的钝酶化效果，结果表明升高温度有利于增强超声波的钝酶效果。

从以上试验结果得出，在25 ℃、功率≤260 W条件下处理PPO和POD时，钝酶效果优于冰浴条件（0 ℃、功率≤260 W），考虑到实际生产成本以及仪器使用寿命，可选择260 W超声波结合不同温度处理作进一步研究。

2.4 260 W超声功率下不同温度对PPO和POD活力的影响

由图4可知，随着处理温度的升高和时间的延长，PPO和POD残留酶活力逐渐降低；在25 ℃、35 ℃、45 ℃下处理 10 min，PPO 活力分别下降至69.9%、42.1%、28.8%，POD活力分别下降至69.9%、57.6%、40.7%，表明POD耐受性强于PPO。一方面，这可能是因为温和热处理（25 ℃～45 ℃）对POD热降解的反应速率常数k影响不大，此时蛋白质二、三级结构受热影响较小，酶活力降低更加依赖时间效应，因而POD更耐热［29］；另一方面，PPO前体一般由N-端导肽、富含His残基的Cu结合区和疏水性C-端3部分组成［30］，超声波处理可能使埋藏在C-端的疏水基暴露，因而PPO对超声波更敏感。

图4 260 W下不同温度对莲藕PPO和POD活力的影响Fig.4 Effects of different temperatures on PPO and POD activity of lotus root under 260 W

在45 ℃、260 W条件下处理的钝酶效果，显著高于单独超声波（0 ℃、260 W）或单独热处理（45 ℃、10 min）的钝酶效果，结果表明热处理和US处理对钝化莲藕中PPO和POD具有协同作用。可能是因为超声波产生的稳定空化气泡在液体介质中传播时会在周围产生微射流和剪切力［31］，它们会破坏维持酶蛋白空间构象的氢键、范德华力等次级键，导致酶分子二级、三级结构改变，影响酶分子热稳定性，使其在较低温度下失活［32］。

3 结语

本研究的试验结果表明：（1）温度≤45 ℃的处理对酶液中PPO和POD的钝化效果不显著；随着处理温度的升高和保温时间的延长，PPO和POD活力逐渐减弱。在75 ℃下处理10 min，PPO和POD都基本失活，但POD的耐热性强于PPO；（2）经过单独US处理后，随着处理功率的增加和处理时间的延长，PPO活力显著下降；随着超声处理时间的延长，POD活力先显著下降后趋于平缓；（3）超声波结合不同温度处理酶液后，钝酶效果显著强于单独的US处理或单独的热处理。试验证实了US结合热处理对PPO和POD的钝化效果具有协同作用，并得到两者结合处理后钝酶效果最好的处理条件：45 ℃、260 W处理10 min。以上试验结果不仅为超声波钝化PPO和POD提供了理论数据，也为鲜切莲藕的超声波保鲜技术的发展提供了一定的理论支撑。