骨病回生丸对激素性股骨头坏死大鼠的作用*

罗丹，曹玉举，郭永昌

郑州中医骨伤病医院，河南 郑州 450016

激素性股骨头坏死是指由于长期使用激素导致的股骨头局部血运不良、骨细胞缺血性坏死、骨小梁断裂、股骨头塌陷的病变，常出现髋部疼痛、跛行、髋关节活动不利等症状［1］。调查指出［2］，我国股骨头坏死的患病率约为7.92／万～11.76／万，其中激素性股骨头坏死占比超过57%，且随着激素类药物应用的不断增加，激素性股骨头坏死的患病率逐渐升高，危害极大。目前，临床上对于激素性股骨头坏死无特效治疗方案，早期患者多采用药物治疗改善骨代谢，如阿仑膦酸钠等，但疗效并不理想［3］。骨病回生丸以三七、丹参、土鳖虫、穿山甲、没药等中药材入药，具有活血化瘀、补气养血、舒筋通络的功效，主治各类骨坏死，尤其是瘀血型股骨头坏死。研究指出，骨病回生丸对早中期激素性、创伤性、酒精性等股骨头坏死有较好疗效，可改善髋关节功能［4］，但其对激素性股骨头坏死的作用机制尚不明确。Toll样受体4（toll like receptor 4，TLR4）是Toll样受体家族最重要、作用最活跃的成员之一，可参与炎症反应、细胞增殖与凋亡、免疫紊乱等病理生理过程，而其下游的核因子－κB（nuclear factor－κB，NF－κB）可参与细胞对外界刺激的响应，如介导肿瘤坏死因子－α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）、白细胞介素－6（interleukin－6，IL－6）的合成和分泌而引发炎性损伤等。既往报道中指出，TLR4过度激活可参与激素性股骨头坏死的发生，且股骨组织可见明显的炎性损伤［5－6］。基于此，本研究选用激素性股骨头坏死大鼠模型，探讨骨病回生丸治疗激素性股骨头坏死的作用机制，以期为该药物的临床应用奠定基础。

1 材料

1.1 动物SPF级SD大鼠58只，雌雄各半，7～9周龄，180～220 g，购自上海医科大学实验动物中心，生产许可证号：SCXK（沪）2019－0001，使用许可证号：SYXK（沪）2019－0058。饲养环境：温度18～26℃，相对湿度40%～60%，12 h光照／12 h黑暗，自由饮食和进水。本研究经河南省实验动物中心审批通过，伦理批号：201910－004。

1.2 药物与试剂骨病回生丸（郑州中医骨伤病医院，规格：6 g／丸，豫药制字：Z04010272）；注射用甲泼尼龙琥珀酸钠（比利时辉瑞公司，规格：0.5 g／支，进口药品注册证号：H20080284）；注射用青霉素钠（华北制药集团有限责任公司，规格：80万U，国药准字：H13020657）；阿仑膦酸钠（杭州默沙东制药有限公司，规格：70 mg／片，国药准字：J20130085）。大肠杆菌内毒素（美国Sigma公司，货号：QM8005P）；乙二胺四乙酸二钠溶液（北京豫维科技有限公司，货号：GBW060340）；苏木素－伊红（hematoxylin－eosin，HE）染色试剂盒（上海信帆生物科技有限公司，批号：201904）；大鼠TLR4、TNF－α、IL－6 ELISA检测试剂盒（北京中衫金桥生物技术有限公司，批号：201903126、201905241、201904268）；Trizol试剂盒（美国Invitrogen公司，货号：R1613574）；逆转录试剂盒（美国Fermentas公司，批号：1904A）；5×细胞裂解液（上海曼博生物医药科技有限公司，货号：RP05－100）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒（美国Sigma公司，批号：20190816002）；兔抗鼠TLR4、NF－κB、p－NF－κB、TNF－α、IL－6、β－actin单克隆抗体及过氧化物酶标记的山羊抗兔TLR4、NF－κB、p－NF－κB、TNF－α、IL－6、β－actin多克隆抗体（美国Maxim公 司，批 号：190415、190512、190627、190520、190618、190821、190514、190621、190830、190611、190720、190914）；TLR4、NF－κB、TNF－α、IL－6引物序列委托宝生物工程（大连）有限公司合成。

1.3 仪器ZQP－86型组织切片机（上海之信仪器有限公司）；DSX100型光学显微镜（日本Olympus公司）；UV2550型紫外分光光度计（上海岛津器材有限公司）；Premier 6软件（加拿大Premier公司）；7500型PCR仪（美国Thermo公司）；1658033型凝胶电泳仪及Quantity One配套分析系统（美国Bio－Rad公司）。

2 方法

2.1 动物建模、分组与药物干预58只SD大鼠按随机数字表法分为建模组（n＝50）和空白对照组（n＝8）。建模组大鼠首先腹腔注射97.92μg·kg－1的大肠杆菌内毒素，每天1次，连续2次，并于末次注射24 h后臀部肌肉注射24.5 mg·kg－1的注射用甲泼尼龙琥珀酸钠，每周1次，连续6周，建立激素性股骨头坏死大鼠模型［7］，同时注射8万U青霉素钠预防感染，每周2次。空白对照组注射等体积无菌生理盐水。建模结束后，随机取2只建模组大鼠处死进行HE染色，光镜下观察大鼠股骨组织的病理变化。若出现骨小梁减少或断裂、空骨陷窝增加、脂肪细胞增加等，表明建模成功。建模成功后，建模组大鼠采用随机数字表法分为模型组（n＝8）、阿仑膦酸钠组（n＝10）、骨病回生丸低剂量组（n＝10）、骨病回生丸中剂量组（n＝10）及骨病回生丸高剂量组（n＝10）。阿仑膦酸钠组大鼠颈部皮下注射150μg·kg－1阿仑膦酸钠，骨病回生丸低、中、高剂量组大鼠的给药量按人与大鼠的体表面积折算系数进行计算（骨病回生丸临床剂量为18 g·d－1，成人体重按60 kg计，给药剂量为0.3 g·kg－1·d－1，大鼠临床等效剂量：0.3 g·kg－1·d－1×6.3＝1.89 g·kg－1·d－1），分别灌胃给予骨病回生丸溶液1.89 g·kg－1、3.78 g·kg－1、7.56 g·kg－1，给药体积为10 mL·kg－1，空白对照组和模型组予以等体积生理盐水灌胃，每天1次，持续4周。给药期间，骨病回生丸低、高剂量组各有1只大鼠因灌胃操作不慎穿破食管而死，剔除本研究。

2.2 HE染色观察大鼠股骨组织的病理变化取大鼠右侧股骨组织，固定24 h后，加入10%的乙二胺四乙酸二钠溶液脱钙，乙醇溶液梯度洗脱，石蜡包埋，冷冻，切片（厚度为4μm），40℃温水展开，烤干后采用HE染色试剂盒染色，中性树胶封固，光镜下观察大鼠股骨组织的病理变化。

2.3 ELISA法检测大鼠血清中TLR4、TNF－α、IL－6的水平分别于干预前及干预1周、2周、4周后取大鼠尾静脉血，严格按照试剂盒说明书操作，采用ELISA法检测大鼠血清中TLR4、TNF－α、IL－6的水平。

2.4 RT－qPCR法检测股骨组织TLR4 m RNA、NF－κB m RNA、TNF－αm RNA及IL－6 m RNA的相对表达量每组取3只大鼠的股骨组织研磨，采用Trizol标准分离法提取总RNA，采用逆转录试剂盒将其逆转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增。不同基因的引物序列和扩增产物长度见表1。反应体系共25μL，反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，59℃退火30 s，50℃延伸10 s，重复35个循环。PCR反应产物纯化后，以β－actin为内参基因，采用配套的分析系统，以2－△△Ct法计算目的基因相对表达量。

表1 不同基因引物序列和扩增产物长度

2.5 Western Blot法检测大鼠股骨组织中TLR4、NF－κB、TNF－α、IL－6及p－NF－κB的蛋白表达水平 每组取3只大鼠的股骨组织研磨，加入细胞裂解液，提取总蛋白，BCA试剂盒对总蛋白进行定量。蛋白凝胶电泳，转膜，封闭过夜。加入一抗（1∶1 000），4℃孵育过夜，加入二抗（1∶5 000），室温孵育2 h。洗膜、曝光、显影。将目的蛋白条带灰度值与内参条带灰度值的比值记为目的蛋白的相对表达量。

2.6 统计学方法采用SPSS 24.0软件对数据进行统计学分析，计量资料以平均值±标准差（±s）表示。重复测量的计量资料采用重复测量方差分析和LSD－t检验；多样本计量资料采用单因素方差分析和SNK－q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 骨病回生丸对激素性股骨头坏死大鼠股骨组织病理改变的影响光镜下显示，空白对照组大鼠软骨细胞排列整齐，骨小梁排列规则、致密饱满、周边可见成骨细胞和少量破骨细胞，空骨陷窝少见，髓腔内未见脂肪细胞增生及肥大；模型组大鼠软骨细胞呈簇状肥大、排列不规则，骨小梁减少、断裂，骨细胞坏死，空骨陷窝和脂肪空泡数目多；各给药组大鼠股骨组织病理改变得到明显改善，其中以骨病回生丸高剂量组作用最佳，大鼠股骨组织软骨细胞基本排列整齐，骨小梁基本规则排列，空骨陷窝、脂肪空泡数目少。见图1。

图1 骨病回生丸对激素性股骨头坏死大鼠股骨组织病理改变的影响（HE染色，×200）

3.2 骨病回生丸对激素性股骨头坏死大鼠血清中TLR4、TNF－α、IL－6水平的影响干预前，与空白对照组比较，其余各组大鼠血清中TLR4、TNF－α、IL－6水平均显著升高（P＜0.05）。干预1周、2周、4周后，与空白对照组比较，模型组大鼠血清中TLR4、TNF－α、IL－6水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，阿仑膦酸钠组和骨病回生丸给药组大鼠血清中TLR4、TNF－α、IL－6的水平均显著降低（P＜0.05）。见表2－表4。

表2 骨病回生丸对激素性股骨头坏死大鼠血清中TLR4水平的影响 （±s，μg·L－1）

表2 骨病回生丸对激素性股骨头坏死大鼠血清中TLR4水平的影响 （±s，μg·L－1）

注：与空白对照组比较，a P＜0.05；与模型组比较，b P＜0.05

组别 n TLR4干预前 干预1周 干预2周 干预4周2.52±0.48 2.62±0.42 2.58±0.46 2.60±0.44模型组 8 8.79±1.52a 10.17±1.80a 12.48±1.90a 15.87±2.01a阿仑膦酸钠组 10 8.81±1.60a 6.02±1.13b 5.04±1.08b 4.05±0.82b骨病回生丸低剂量组 9 8.76±1.58a 7.14±1.46b 6.01±1.25b 5.00±1.04b骨病回生丸中剂量组 10 8.80±1.59a 6.00±1.15b 5.06±1.10b 4.07±0.82b骨病回生丸高剂量组 9 8.78±1.61a 5.11±0.96b 4.08±0.81b 3.15±0.59空白对照组8 b

表4 骨病回生丸对激素性股骨头坏死大鼠血清中IL－6水平的影响 （±s，ng·L－1）

表4 骨病回生丸对激素性股骨头坏死大鼠血清中IL－6水平的影响 （±s，ng·L－1）

注：与空白对照组比较，a P＜0.05；与模型组比较，b P＜0.05

组别 n IL－6干预前 干预1周 干预2周 干预4周12模型组 8 89.69±8.71a 102.48±9.75a 110.89±10.83a 122.47±12.05a阿仑膦酸钠组 10 91.22±9.15a 73.25±7.63b 66.55±6.39b 58.54±5.08b骨病回生丸低剂量组 9 90.37±9.10a 80.15±8.36b 71.77±6.53b 62.52±5.89b骨病回生丸中剂量组 10 89.97±9.50a 74.20±8.12b 66.97±6.52b 59.12±5.18b骨病回生丸高剂量组 9 90.74±9.08a 68.58±6.90b 60.43±6.11b 50.75±6.14空白对照组 8 45.47±4.85 44.88±5.08 45.30±4.96 45.07±6.b

3.3 骨病回生丸对激素性股骨头坏死大鼠股骨组织TLR4mRNA、NF－κB m RNA、TNF－αm RNA、IL－6 m RNA相对表达量的影响与空白对照组比较，模型组大鼠股骨组织中TLR4 mRNA、NF－κB mRNA、TNF－αmRNA、IL－6 mRNA相对表达量显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，阿仑膦酸钠组和骨病回生丸给药组股骨组织中TLR4 mRNA、NF－κB mRNA、TNF－αmRNA、IL－6 mRNA相对表达量显著降低（P＜0.05）。见表5。

表3 骨病回生丸对激素性股骨头坏死大鼠血清中TNF－α水平的影响 （±s，ng·L－1）

表3 骨病回生丸对激素性股骨头坏死大鼠血清中TNF－α水平的影响 （±s，ng·L－1）

注：与空白对照组比较，a P＜0.05；与模型组比较，b P＜0.05

组别 n TNF－α干预前 干预1周 干预2周 干预4周12模型组 8 59.75±5.89a 78.74±7.96a 101.33±10.20a 132.29±15.96a阿仑膦酸钠组 10 60.22±5.96a 49.74±4.98b 40.02±4.10b 31.28±4.15b骨病回生丸低剂量组 9 59.14±5.77a 54.55±5.08b 46.41±4.93b 40.35±4.17b骨病回生丸中剂量组 10 59.47±5.53a 50.11±4.79b 40.19±4.22b 30.97±4.24b骨病回生丸高剂量组 9 60.35±6.02a 41.04±4.83b 32.01±4.05b 20.18±3.15空白对照组 8 11.48±2.02 11.94±2.10 11.85±2.07 11.55±2.b

表5 骨病回生丸对激素性股骨头坏死大鼠股骨组织TLR4 mRNA、NF－κB mRNA、TNF－αmRNA、IL－6 m RNA相对表达量的影响 （±s）

表5 骨病回生丸对激素性股骨头坏死大鼠股骨组织TLR4 mRNA、NF－κB mRNA、TNF－αmRNA、IL－6 m RNA相对表达量的影响 （±s）

注：与空白对照组比较，a P＜0.05；与模型组比较，b P＜0.05

组别 n TLR4 mRNA NF－κB mRNA TNF－αmRNA IL－6 mRNA空白对照组0.52±0.07 0.68±0.09 0.71±0.10 0.59±0.08模型组 3 1.45±0.19a 1.53±0.17a 1.62±0.17a 1.60±0.17a阿仑膦酸钠组 3 0.95±0.15b 1.01±0.12b 1.07±0.13b 1.18±0.12b骨病回生丸低剂量组 3 1.18±0.15b 1.30±0.14b 1.34±0.15b 1.30±0.15b骨病回生丸中剂量组 3 0.93±0.14b 0.98±0.13b 1.09±0.13b 1.16±0.11b骨病回生丸高剂量组 3 0.76±0.12b 0.79±0.11b 0.85±0.12b 0.89±0.14 3 b

3.4 骨病回生丸对激素性股骨头坏死大鼠股骨组织TLR4、NF－κB、TNF－α、IL－6及p－NF－κB蛋白表达水平的影响与空白对照组比较，模型组大鼠股骨组织TLR4、NF－κB、TNF－α、IL－6及p－NF－κB蛋白相对表达量显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，阿仑膦酸钠组和骨病回生丸给药组股骨组织TLR4、NF－κB、TNF－α、IL－6及p－NF－κB蛋白相对表达量显著下降（P＜0.05）。见图2、表6。

图2 骨病回生丸对激素性股骨头坏死大鼠股骨组织

表6 骨病回生丸对激素性股骨头坏死大鼠股骨组织TLR4、NF－κB、TNF－α、IL－6及p－NF－κB蛋白表达水平的影响 （±s）

表6 骨病回生丸对激素性股骨头坏死大鼠股骨组织TLR4、NF－κB、TNF－α、IL－6及p－NF－κB蛋白表达水平的影响 （±s）

注：与空白对照组比较，a P＜0.05；与模型组比较，b P＜0.05

组别 n TLR4 NF－κB TNF－α IL－6 p－NF－κB 10±0.03模型组 3 0.35±0.07a 0.49±0.09a 0.45±0.04a 0.51±0.06a 0.33±0.05a阿仑膦酸钠组 3 0.24±0.03b 0.27±0.04b 0.25±0.04b 0.26±0.04b 0.22±0.04b骨病回生丸低剂量组 3 0.30±0.05b 0.32±0.05b 0.31±0.04b 0.30±0.04b 0.28±0.04b骨病回生丸中剂量组 3 0.25±0.04b 0.27±0.05b 0.26±0.05b 0.27±0.05b 0.23±0.05b骨病回生丸高剂量组 3 0.15±0.03b 0.19±0.04b 0.18±0.03b 0.16±0.04b 0.13±0.03空白对照组 3 0.11±0.03 0.12±0.03 0.09±0.03 0.09±0.03 0.b

4 讨论

长期应用激素类药物可导致脂质代谢紊乱，血脂处于较高水平，血液黏滞性增加而流动性减小。股骨头因血供不丰富，容易发生血供障碍，易出现股骨头坏死现象。而脂代谢紊乱也可影响骨代谢，导致骨形成减少，升高股骨头坏死的发病率［8－10］。临床上针对激素性股骨头坏死多采用药物保守治疗或手术治疗，阿仑膦酸钠是常用的改善骨代谢的药物，虽有一定作用，但综合效果不佳。手术治疗可对机体造成严重创伤，再加上术后恢复缓慢，费用高，具有一定局限性。因而，迫切需要探讨合理、可行的治疗方案。

大肠杆菌内毒素腹腔注射联合臀部肌肉注射甲泼尼龙琥珀酸钠是目前常用的激素性股骨头坏死的建模方法，其中大肠杆菌内毒素腹腔注射可影响脂代谢，臀部肌肉注射甲泼尼龙琥珀酸钠则是直接利用激素诱导发挥作用，二者配合可缩短激素性股骨头坏死的发病时间，提高建模成功率［11］。本研究中，HE染色发现造模大鼠出现骨小梁稀疏、结构紊乱，骨细胞坏死，空骨陷窝数量增多，成骨细胞数目减少，脂肪空泡数目增多等典型激素性股骨头坏死的病理表现，证实建模成功，表明该方法可行。

激素性股骨头坏死不仅可导致骨形成减少，还可出现骨组织炎性损伤。骨病回生丸由三七、土鳖虫、没药、丹参等中药制成，三七可消肿定痛、活血化瘀，土鳖虫可续筋接骨、逐血化瘀，丹参祛瘀活血、凉血消肿，没药消肿止痛、活血生肌，全蝎通络止痛，穿山甲祛风定惊、化瘀散结，党参健脾益肺、养血生津，当归补血活血，鳖甲软坚散结，黄芪利尿生肌、托毒排脓、补气固表，蜈蚣通络镇痛、熄风镇痉、攻毒散结，全方合用，行通经活络、补气养血、活血化瘀之效［12］。现代药理研究指出，三七中的有效成分有助于控制机体炎症反应，减轻组织炎性损伤［13］；丹参中的有效成分可改善骨代谢，促进骨形成［14］。研究显示，骨病回生丸治疗激素性股骨头坏死有助于改善患者的脂代谢指标，减轻炎症反应［15］。本研究发现，与空白对照组比较，模型组大鼠血清中TLR4、TNF－α、IL－6的水平显著升高；与模型组比较，阿仑膦酸钠组和骨病回生丸给药组大鼠血清中TLR4、TNF－α、IL－6的水平显著下降，且骨病回生丸的作用呈明显剂量依赖性。文献表明，阿仑膦酸钠可改善骨代谢，增强骨质，抑制股骨细胞凋亡，减轻激素性股骨头坏死病理状况，降低血清TLR4、TNF－α、IL－6的水平［16］。而本研究结果显示，骨病回生丸高剂量组的效果优于阿仑膦酸钠组，提示骨病回生丸在激素性股骨头坏死临床治疗中有一定的可行性。

TLR4信号通路的过度激活与激素性股骨头坏死的发生发展关系密切。TLR4的结构分为胞外域、跨膜域和胞内域，其中胞外域是一段重复的亮氨酸序列，可介导病原体相关分子模式的识别，而胞内域则 是 一 段 高 度 保 守 的 序 列［17－19］。TLR4可 使NF－κB复合物中的抑制成分磷酸化而脱颗粒，引起NF－κB持续活化和磷酸化，且NF－κB还受其他基因的调控，如蛋白激酶B等［20－21］。活化的NF－κB可与κB序列特异性结合，促进各种炎症因子的转录，产生级联炎症反应，IL－6和TNF－α的表达水平升高，进一步介导炎症反应［22－24］。报道指出，NF－κB属于炎症反应中重要的转录因子，可调控成骨细胞与破骨细胞的功能，有助于维持骨稳态，但是当受到炎性反应刺激后，TLR4过度活化，NF－κB持续激活，p－NF－κB水平增高，诱导TNF－α和IL－6的表达，从而对骨组织造成损害［25］。研究显示，激素性股骨头坏死患者血清中TLR4、TNF－α和IL－6水平较正常健康志愿者偏高，同时发现，激素性股骨头坏死患者存在炎症反应，需予以控制［26］。动物实验研究显示，抑制TLR4基因与蛋白的表达有助于减轻激素性股骨头坏死大鼠股骨组织病理改变，促进骨形成［27］。本研究中，模型组大鼠股骨组织中TLR4、NF－κB、TNF－α、IL－6基因和蛋白的表达水平及p－NF－κB的蛋白表达水平均高于空白对照组，而骨病回生丸给药组相关蛋白和基因的表达水平均低于模型组，说明骨病回生丸可抑制激素性股骨头坏死大鼠TLR4的过度表达，降低NF－κB、TNF－α、IL－6、p－NF－κB的表达水平，且骨病回生丸高剂量组的作用最佳。

综上所述，骨病回生丸可明显改善激素性股骨头坏死，其作用机制可能与抑制机体炎症反应有关。