高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨率质谱法测定鸡蛋中磺胺喹噁啉与二甲氧苄啶残留

宋占腾，肖志明，樊霞，李阳，索德成

（中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京 100081）

磺胺喹噁啉（Sulfaquinoxaline，SQX）是具有对氨基苯磺酰胺结构的一类广谱型抗菌药物，该药物性质稳定、促进生长、抗菌活性显著，同时在饲料中添加作为促生长剂使用，被广泛应用于畜禽养殖领域[1-3]。二甲氧苄啶俗称敌菌净（Diaveridine，DVD），为动物专用抗菌增效剂，是含有5-取代苄基-2,4-二氨基嘧啶的化合物，能够作为二氢叶酸还原酶可逆性抑制剂，阻碍二氢叶酸还原为四氢叶酸，影响辅酶的形成，从而影响微生物DNA、RNA及蛋白质的合成，抑制了其生长繁殖。与磺胺喹噁啉联用时，可产生协同抗菌作用，使细菌体内叶酸代谢受到双重阻断，抗菌作用增强数倍至数十倍[4]。随着家禽养殖业现代化、规模化、集约化的发展，磺胺与磺胺增效剂联合被大量应用于家禽养殖过程。然而，磺胺与磺胺增效剂在体内的代谢缓慢[5,6]，存在于机体时间较长、大多不能被完全吸收，并通过食物链最终对人体健康产生危害[7-9]。过量的SQX添加后容易在鸡蛋中残留，循环至人体蓄积后损伤肝脏、肾脏等，且具有潜在的致癌性[10-14]。各国均制定了休药期来控制动物性食品中的磺胺药物残留。欧盟、加拿大、美国规定了动物组织中磺胺类药物最大残留量总量为100 μg/kg，日本为20 μg/kg，我国农业部235号公告规定了组织中磺胺类药物最大残留量总量为100 μg/kg，农业部163号公告规定蛋鸡产蛋期均禁止使用磺胺类药物[15,16]。

目前对于鸡蛋中SQX与DVD的检测方法主要有高效液相色谱法[17,18]、气相色谱法[19]、液质联用[20,21]、免疫测定法[22]等，样品提取净化的方法主要有液液萃取法[23]、固相萃取法[24]和QuEChERS法[25]，本研究建立了一种多重机制杂质吸附净化，将提取液高速离心后转移上清液，加入多重机制吸附净化材料，同时使用高效液相色谱串联四极杆/静电场轨道离子阱高分辨率质谱（Q Exactive HF，HRMS）检测，以期为鸡蛋产品的磺胺药物及增效剂的残留监控提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 实验仪器

Q Exactive HF，HRMS轨道离子阱高分辨质谱仪[带有热电喷雾离子源（HESI源）]，美国Thermo Fisher公司；Acquity UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm），美国Waters公司；Oasis HLB固相萃取小柱、OasisMAX固相萃取小柱（3 cc，60 mg），美国Waters公司；超声波清洗器，Fungilab公司；高速台式离心机，Sigma公司；QL-901Vortex自动涡旋混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；0.22 μm聚四氟乙烯（PTFE）滤膜，购于上海安谱实验科技股份有限公司；超纯水器，美国MILLIPORE公司；L18-Y88匀浆机，济南九阳股份有限公司。

1.1.2 实验材料

前处理吸附材料Cleanert S C18：粒径50 μm ；Cleanert S SLE（硅藻土）：粒径150 μm；Cleanert S中性氧化铝（Alumina-N）：粒径150 μm；Cleanert S活性碳（Carb）：粒径120～400 mesh；Cleanert S Nano Carb：粒径10～20 nm，购置于Agela Technologies公司。吸附材料BONDESIL-SAX：粒径40 μm；BONDESIL-SCX：粒径40 μm；BONDESIL-PSA：粒径40 μm；BONDESIL-FL：粒径200 μm，购置于Agilent Technologies公司。羟基化多壁碳纳米管（HMCN），购置于先丰纳米材料科技有限公司。多重机制吸附填料：称取6g BONDESIL-SAX、3g Cleanert S C18于50 mL三角瓶中，混合均匀，备用。

磺胺喹噁啉（SQX）和二甲氧苄啶（DVD）分别购置于Dr. Ehrenstorfer (Augsberg，Germany)，Aladdin（上海晶纯生化科技股份有限公司）；甲酸（色谱纯），Sigma公司；乙腈和甲醇（色谱纯），Fisher ChenAlert Guide公司；其他试剂均为分析纯试剂，实验用水为Mili-Q纯化后的超纯水（>18 MΩ）。

1.1.3 试验样品

鸡蛋样品来源：选取不同地规模化养殖场及商场与超市，随机购买采集40份鸡蛋样品；阳性鸡蛋样品通过动物实验获得，依据饲料药物添加剂使用规范[16]，常温下混饲给予100 mg/kg的二甲氧苄啶和50 mg/kg的磺胺喹噁啉药物，连续给药5 d，分别于不同停药期采集鸡蛋样品。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液的制备

取SQX与DVD对照品各适量，精密称定，用甲醇溶解，制成500 μg/mL的标准储备液，于20 ℃冷藏保存，有效期6个月；精密量取SQX与DVD储备液各适量，置于同一量瓶中，经甲醇稀释，制得磺胺类药物500 ng/mL的混合标准工作液，现用现配。

1.2.2 溶液配制

精密量取1 mL甲酸，用水稀释至1000 mL，制得0.1%甲酸水溶液。精密量取100 mL乙腈，用0.1%甲酸水溶液定容至1000 mL，制得含0.1%甲酸-乙腈（9:1，V/V）溶液。精密量取1 mL甲酸，用乙腈稀释至100 mL，制得1%甲酸乙腈溶液。

1.2.3 样品前处理

取数枚新鲜鸡蛋，清洗干净去壳后，置于匀浆机充分搅拌均匀，称取此鸡蛋样品5 g（精确至0.01 g）于50 mL聚丙烯离心管中，加入20 mL 1%甲酸乙腈溶液，涡旋混合5 min，静置30 min；置于摇床125 r/min，40 ℃恒温下振摇1 h，超声提取40 min，9000 r/min离心5 min；移取上清液5 mL于干净的10 mL离心管，加入50 mg多重机制吸附填料，涡旋混合后超声15 min，9000 r/min离心5 min，移取全部上清液40 ℃下氮气吹干，加入0.5 mL 0.1%甲酸-乙腈（9:1，V/V）溶液，涡旋振荡30 s，经0.22 μm聚四氟乙烯（PTFE）滤膜过滤后，用Q Exactive HF，HRMS测定。若样品中含量超出线性范围，用样品稀释液稀释至线性范围内上样。

1.2.4 色谱与质谱条件

色谱柱：Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱温：30 ℃；进样量：5 μL；流动相：A为0.1%甲酸水，B为0.1%甲酸甲醇。流量、流动相和梯度洗脱见表1。

质谱采用热电喷雾离子源（HESI），正离子模式（positive），平行反应监测（PRM）；鞘气流速：40；辅助气流速10；喷雾电压3.0 kV；毛细管温度：320 ℃；S-lens电压：55；辅助气加热温度：300 ℃；AGC target（Orbitrap容纳的离子数量）：2e4；分辨率（Resolution）：120000；隔离窗口（Isolation window）：2.0 u；归一化碰撞能（NCE/steppednce）：20、40、60。脱溶剂气和锥孔气均为氮气；使用前调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求。质谱扫描参数及各药物质谱条件见表2。

表2 SQX和DVD的质谱条件Table 2 Mass spectroscopic conditions of SQX and DVD

1.2.5 数据处理

将系列标准溶液、样品溶液按上述仪器方法上机进行测定，采用MassLynx软件进行数据处理与分析。

2 结果与分析

2.1 色谱和质谱条件

文献报道中选用了多种流动相来达到各类化合物较好的分离效果，本文选择甲醇为流动相的有机相是因为为甲醇与乙腈相比极性较强，当流动相梯度条件相同时，反相色谱中洗脱能力较乙腈弱，分析物保留时间更长。甲醇可使DVD的保留时间相对推后，同时甲醇会提高离子化程度，峰面积比以乙腈为流动相时大。磺胺类药物在酸性溶液中能以分子状态存在，很好地与固定相作用而被保留和分离，且电离时能较好地生成[M+H]+而被检测。在水相和有机相中同时加入0.1%甲酸，能够促进电离，有效提高了灵敏度。通过流动相梯度洗脱，能在10 min内有效的分离两种化合物，缩短了保留时间，且所有同分异构体均能分离完全，并能够获得较好的峰形，满足确证与准确定量的要求。同时在很大程度上节省了溶剂消耗，降低了分析成本和废液产生。两种化合物离子流色谱图见图1。

图1 Q Exactive HF，HRMS扫描TIC图Fig.1 Q Exactive HF, HRMS scanning TIC diagram

Q Exactive HF，HRMS轨道离子阱高分辨质谱仪平行反应监测（Parallel Reaction Monitoring，PRM）是一种基于高分辨、高精度质谱的离子监视技术，能对目标分析物进行选择性检测，从而实现对目标物进行绝对定量。利用四级杆质量分析器的选择能力，用Q1选择目标物的母离子；最后利用精度分析器在二级质谱中检测所选的母离子窗口内的所有碎片的信息。相比于传统SRM/MRM只检测目标离子对的模式，平行反应监测PRM相对定量技术不仅具有SRM/MRM的靶向定量分析能力，还同时具备了定性能力。

将2种待测目标化合物标准溶液以5 μL/min注入电喷雾离子源，各物质在正离子模式下可得到准分子离子峰[M+H]+。将其作为前体离子，再进行子离子扫描二级质谱分析，选择丰度较大的两个碎片离子，其中丰度较高的一个碎片离子作为定量离子，其余碎片离子作为辅助定性离子，分别对喷雾电压、毛细管温度、鞘气流速等质谱参数进行优化。2种磺胺类化合物的增强子离子扫描质谱图见图2。

图2 增强子离子扫描质谱图Fig.2 Scanning mass spectrum of enhancer ion

通过精确的质量分析，多级质谱碎片离子信息，相对丰度及相关文献报道，对比发现SQX在一定碰撞能量下，得到m/z为（156.0762±0.0001）的碎片离子，以及m/z为（108.0442±0.0001）的碎片离子，初步推测与磺胺类化合物结构中的苯磺酰胺（C6H7NO2S）结构相符。DVD有特征为（123.0662±0.0001）的碎片离子，初步推断分子式与6-甲基-2,4-嘧啶二胺（C5H8N4）结构相符。

2.2 提取条件选择

磺胺与增效剂在结构与性质上较为接近，本实验在参考大量文献的基础上[26-29]，考察了乙腈、乙酸乙酯、水/乙腈（20:80，V/V）对各类磺胺药物及增效剂的提取效率，结果表明，乙酸乙酯提取后基质影响较大，乙腈类溶液提取效率要好于乙酸乙酯，这是由于磺胺及增效剂结构中含有多个氨基，呈强极性，难溶于非极性溶剂，易溶于极性有机溶剂，同时充分利用了乙腈能使蛋白质变性沉淀的作用，使得分析目标物能够较好的溶解。此外，由于磺胺类药物具有弱碱性，易溶于酸性溶液，采用甲酸－乙腈混合溶剂的提取效率要高于乙腈。同时实验对甲酸的用量进行优化，随着甲酸浓度增加，大部分磺胺的回收率下降，因此采用甲酸－乙腈（1:99，V/V）混合溶液作为提取溶剂。

2.3 净化方式选择

鸡蛋中富含脂肪、蛋白质、磷脂等基质，存在杂质多、基质干扰严重、回收率偏低等问题，有效去除干扰因素是兽药残留检测的重要节点，混合模式吸附剂净化是一种基于介质分散固相萃取的方法，此方法主要通过多种不同粒径功能化吸附材料，将样品中的主要干扰杂质吸附，有效地去除基体中可能存在的磷脂、脂肪和部分蛋白质等，同时将被测物质留在样品溶液中，而达到净化和富集的目的。该方法快速、简单，可大大节省样品前处理的时间。样品提取液经过离心后移取上清液5 mL，通过加入不同种吸附材料净化，其10种吸附材料名称类型见表3，对SQX和DVD的回收率见图3。

表3 吸附材料名称与类型Table 3 Names and types of adsorbent materials

图3 不同吸附材料对SQX和DVD回收Fig.3 Recovery efficiency of SQX and DVD with different adsorbent materials

由图3得知，提取液经FL、ALMN、SLE、NONO净化吸附时，SQX和DVD基质干扰明显，回收率偏低；SCX和PSA对两种化合物有一定回收效果，但同批次内偏差较大。两种化合物经过SAX和C18分别吸附净化时，样品溶液颜色有较明显的吸附净化效果，C18固体吸附剂有效防止了非极性化合物进入色谱柱，对五种原药回收率达到较好的效果。因此将SAX和C18通过不同配比混合来进行吸附净化，进一步提高回收效率。经过不同比例以及不同添加量对样品吸附效率的考察，最终确定SAX与C18比例为2:1，添加量达到50 mg时，吸附效率达到最优。SAX和C18对提取液吸附净化效果如图4所示。不同比例添加下对各化合物回收效率见图5。同时考察了吸附材料的使用量，比较了5、10、20、50、80、100 mg不同固体吸附剂加入量对5 mL样品提取液中杂质净化效果的影响。结果表明，当固体吸附材料加入量达50 mg时，继续加大吸附剂的用量对样品杂质的净化效果和回收率无明显改善。因此将吸附材料加入量设定为50 mg。当加入吸附剂吸附净化后，可以有效地除去基质中的干扰物对待测物色谱峰的影响，同时减少杂质对仪器和色谱柱的损害。

图4 SAX和C18吸附净化效果比较Fig.4 Comparison of SAX and C18 adsorption purification effects

图5 不同比例吸附材料对各化合物的回收率Fig.5 Recovery of each compound by different ratios of adsorbent materials

2.4 线性范围、检出限和定量限

SQX和DVD以基质匹配外标法定量，以自身峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。结果显示，在相应的线性范围内，2种化合物均呈现良好的线性关系。在空白样品中添加不同浓度的待测组分，前处理后按浓度由高至低检测，以信噪比≥3，确定方法的检出限为0.1～0.2 μg/kg；以信噪比≥10确定方法的定量限为0.3～0.6 μg/kg；2种化合物的线性方程、相关系数、检出限及定量限如表4所示。

表4 2种化合物的线性范围、线性方程、检出限及定量限Table 4 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients, limits of detection (lods) and limits of quantitation (loqs) of 2 kinds of compounds

2.5 回收率和精密度

精确称取空白鸡蛋样品2 g，加入10、50、200 μg/g的混合标准溶液，将样品在避光条件下静止2 h，使其标准溶液被样品充分吸收，每个添加浓度平行测定6次，按上述优化后的提取方法和仪器条件处理测定。计算SQX和DVD的添加回收率和相对标准偏差。结果表明，该方法在低、中、高3个添加水平下的回收率达到96.4%～106.8%之间（见表5），相对标准偏差为0.5%～7.1%。

表5 鸡蛋样品中SQX与DVD添加回收率及相对标准偏差Table 5 The recovery rate and relative standard deviation of SQX and DVD in egg samples

2.6 样品测定

采用本研究方法分析了不同地规模化养殖场、商场及超市，随机购买采集40份鸡蛋样品；和通过动物实验获得的20份鸡蛋样品，结果表明，随机采集的样品中均未检出SQX与DVD残留，动物实验样品中，8份鸡蛋样品检出SQX为0.7～15.42 mg/kg，DVD为0.23～8.87 mg/kg。函待进一步探究SQX与DVD在鸡蛋中的残留代谢规律。

3 结论

本方法采用酸化乙腈提取后，混合模式吸附剂净化，建立了鸡蛋产品中SQX和DVD的高效液相色谱串联四极杆/静电场轨道离子阱高分辨率质谱（Q Exactive HF，HRMS）方法，结果表明方法具有较高的灵敏度，检出限定量限稳定，并有良好的回收效率，分析方法操作简便、高效、经济、灵敏度和准确度高，并易于普及。