辣木叶水提物对H2O2致HepG2细胞氧化损伤的保护作用

蔡小华，李小伟，李国坤，苏立杰，陈骁熠，吴鑫兰*

（1.广州医科大学公共卫生学院，广东广州 511436）（2.江南大学食品学院，江苏无锡 214122）

机体生长代谢过程中产生的自由基具有多种生理功能，如预防感染、调节细胞信号传导等[1,2]。但是，当机体受到外源性或内源性氧化物质损伤时，体内自由基产生和清除的动态平衡就会遭到破坏，从而引起活性氧在体内堆积并产生细胞毒性作用，这一非正常的生理状态即为氧化应激。过多的自由基会氧化细胞膜、代谢酶系、蛋白质和DNA等物质，还会诱导细胞凋亡，对机体的细胞及器官造成损伤[3,4]。越来越多的证据已表明，氧化应激介导的氧化损伤与许多疾病的发生有关，特别是与心血管疾病、糖尿病、神经退行性疾病、癌症等高发疾病密切相关[5-7]。这些疾病严重损害了患者的身体健康，造成了沉重的经济负担，并给人口老龄化问题带来更大的压力和挑战。因此，开发具有清除自由基的功能性食品和药物日益受到重视[8-10]。

辣木（Moringa oleifera）原产于印度，其属于辣木科辣木属多年生植物，具有十分丰富而全面的营养价值。大量研究表明，辣木（包括辣木叶、辣木根和辣木籽等）具有良好的生理活性[11,12]，引起了全世界的广泛关注。我国卫生部于2012年批准辣木叶为新资源食品。现有的数据显示：辣木叶含有丰富的类黄酮以及多酚类物质，使其具有较强的抗氧化活性[13]。例如，Sllih等[14]利用体外实验对不同季节的辣木叶以及同一辣木不同部位叶子的抗氧化活性进行了比较，发现冬季采收的辣木叶会比夏季所采收的辣木叶具有更强的抗氧化活性。国内学者周伟等[15]利用乙醇对辣木叶的抗氧化活性物质进行提取并用体外化学方法评价其抗氧化活性，发现辣木叶醇提物对DPPH、ABTS和OH自由基均具有较好的清除效果。目前，国内外关于辣木叶抗氧化活性主要是利用体外化学方法进行研究。但是，体外化学方法缺乏生物相关性、生物的复杂机制、作用因素和体内代谢等方面的条件。因此，本研究旨在以过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）诱导氧化损伤的人体肝癌细胞（HepG2 cell）为模型，从细胞水平上测定辣木叶的细胞水平抗氧化能力，在细胞层面上进一步丰富辣木叶抗氧化活性的评价结果。本文以细胞的存活率、细胞内主要的抗氧化酶中的超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD和谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GSH-Px）的活力，以及非酶系统中的丙二醛（Malonaldehyde，MDA）的含量变化来评价辣木叶的抗氧化能力，从而为辣木叶的功能性食品开发及其抗氧化作用机制研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

GSH-Px检测试剂盒、总SOD活性检测试剂盒、MDA检测试剂盒、二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒、细胞裂解液，碧云天生物技术公司；PBS缓冲液、DMEM基础培养基、胰蛋白酶溶液、青霉素/链霉素（即双抗）、胎牛血清，美国GIBCO公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT），美国Amresco公司；二甲基亚砜（DMSO）溶液，美国Sigma公司；30% H2O2溶液，市售分析纯；新鲜辣木叶，厦门天竺实业发展有限公司；HepG2细胞，华南理工大学食品科学与工程学院提供。

1.2 仪器与设备

Multiskan FC酶标仪，美国Thermo公司；SKE-14S超声均质机，宁波市鄞州硕利仪器有限公司；FD-1A-80真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；DK-8D恒温水浴箱，上海一恒科学仪器有限公司；Allegra X-22R离心机，上海宾智生物科技有限；MF52-LED倒置显微镜，广州市明美光电技术有限公司；BNP-80C CO2培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；SW-CJ-1FD超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 辣木叶水提物的制备

采用台式真空冷冻干燥机对新鲜辣木叶进行冷冻，冷冻干燥条件为：温度-80 ℃，工作压力3 MPa，干燥时长1 d。干燥完成后，将辣木叶进行研磨粉碎过筛后，按以下条件进行超声浸提：时间30 min、浸提温度70 ℃、浸提料液比1:40，制得浸提液后趁热过滤备用。

1.3.2 细胞的培养

（1）从液氮罐中取出待复苏的肝癌细胞，立即放入37 ℃的恒温水浴锅中，左右快速摆动使其在2 min内迅速溶解，取出后用75%的酒精棉球擦拭冻存管外壁的水渍并进行消毒处理，放入超净工作台待用。

（2）将溶解后的细胞冻存液快速吸入工作台中已准备好的离心管中，加入2 mL DMEM完全培养基（含10%胎牛血清及1%双抗溶液），800 r/min离心5 min。

（3）弃去上清，向离心管中加入5 mL完全细胞培养基，轻轻吹打均匀后用移液枪转移到灭菌过的细胞培养瓶中，移入37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

（4）待细胞生长较满，约长到培养瓶底部面积的80%～90%左右即可进行传代，弃去培养瓶上清液后加入1 mL胰酶到培养瓶中，消化2 min，弃去瓶中的胰酶后加入3 mL的完全细胞培养基并用移液枪将细胞缓慢地吹打下来并充分混匀，转移到离心管中800 r/min离心5 min，弃去上清加入3 mL培养基，混匀后取3个培养瓶每个培养瓶中吸入1 mL细胞悬液，再加入3 mL培养基，重新放回到培养箱中培养。传代几次待细胞生长稳定后即可进行后续实验。

1.3.3 H2O2诱导HepG2细胞氧化损伤模型建立

取处于对数生长期的HepG2细胞，使用含有10%胎牛血清的DMEM完全培养液稀释成1×105cells/mL；在96孔板每个孔中加入100 μL细胞悬液，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养24 h，弃去上清液，用PBS润洗两次，加入100 μL浓度分别为100、200、300、400、500、600、800 μmol/L用无血清DMEM培养基稀释的H2O2溶液到板孔中，每组溶液设置6个复孔[16]。另设调零组：不加细胞培养，加入100 μL无血清DMEM培养基；空白对照组：加细胞培养24 h，弃去上清后加入100 μL无血清DMEM培养基。弃去上清液，用PBS润洗两次，加入用无血清DMEM培养基配制的0.5 mg/mL的MTT溶液100 μL，继续放入培养箱4 h后，吸尽上清，用PBS润洗两遍，再向每孔加入100 μL的DMSO，酶标仪中37 ℃孵育10 min，在570 nm下测量96孔板的吸光值。根据实验结果计算细胞的半数抑制浓度，使用较为接近半数抑制浓度的H2O2浓度作为接下来的造模试剂[17]。根据以下公式计算细胞存活率：

1.3.4 MTT法检测辣木叶水提物对细胞增殖的影响

取处于对数生长期的HepG2细胞，使用含有10%胎牛血清的DMEM培养液稀释成1×105cells/mL；在96孔板每个孔中加入100 μL细胞悬液，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养24 h，弃去上清液，用PBS润洗两次，加入100 μL浓度分别为100、200、400、500、600、800、1000 μg/mL用无血清DMEM培养基稀释的辣木叶水提物到板孔中（作为药物处理组），每组溶液设置6个复孔。同上，另设调零组（不加HepG2细胞，只加等量的DMEM培养液）和空白对照组。弃去上清液，用PBS润洗两次，加入用无血清DMEM培养基配制的0.5 mg/mL的MTT溶液，继续放入培养箱4 h后，吸尽上清，用PBS润洗两遍，再向每孔加入100 μL的DMSO，酶标仪中37 ℃孵育10 min，在570 nm下测量每孔的吸光值，计算细胞存活率。

1.3.5 MTT法检测辣木叶水提物对细胞的保护作用

参照1.3.4方法将细胞均匀的接种到96孔板中。细胞随机分为8组：空白对照组、调零组（不加HepG2细胞，只加等量的DMEM培养液）、H2O2模型组、不同浓度辣木水提物保护组（100、200、400、500、600 μg/mL）。按照上述分组，培养24 h后弃去上清，用PBS润洗两次。在保护组加入100 μL不同浓度辣木水提物，在空白对照组、阴性对照组和H2O2模型组的每个孔中加入100 μL无血清的DMEM高糖培养基，将96孔板转移至37 ℃、5% CO2细胞培养箱中。培养24 h后弃去上清，用PBS润洗两次。在H2O2模型组和保护组中加入100 μL H2O2（400 μmol/L，用无血清DMEM培养基稀释）溶液；在空白对照组、调零组中加入100 μL无血清的DMEM高糖培养基。将96孔板转移至37 ℃、5% CO2细胞培养箱中进行培养4 h，弃去上清，用PBS润洗两次。加入用无血清DMEM培养基配制的0.5 mg/mL的MTT溶液100 μL，继续放入培养箱4 h后，吸尽上清，用PBS润洗两遍，再向每孔加入100 μL的DMSO，酶标仪中37 ℃孵育10 min，在570 nm下测量每孔的吸光值，计算细胞存活率。

1.3.6 辣木叶水提物对H2O2诱导HepG2细胞抗氧化酶活力相关指标的影响

取处于对数生长期的HepG2细胞接种于6孔培养板，每孔细胞浓度为2.5×105cells/mL，接种体积为每孔1 mL，培养24 h后，按照空白对照组、调零组（不加HepG2细胞，只加等量的DMEM培养液）、H2O2模型组、不同浓度辣木水提物保护组进行实验。各保护组分别加入1 mL浓度为100、200、400、500、600 μg/mL辣木水提物预处理24 h，空白对照组、调零组、H2O2模型组加入等体积的无血清的DMEM高糖培养基处理24 h。弃去上清液，用PBS润洗两次，各保护组以及H2O2模型组再加入1 mL H2O2（400 μmol/L，用无血清DMEM培养基稀释）干预4 h；空白对照组、调零组中加入等体积无血清的DMEM高糖培养基进行处理。干预结束后用PBS清洗2次，然后每孔加入150 μL细胞裂解液，用细胞刮刀将每孔中细胞全部刮净后收集到离心管中，12000 g离心10 min，取上清液备用[18]。参照相关试剂盒要求，测定细胞所含的BCA蛋白浓度、所含MDA水平、SOD活性、GSH-Px活性等相关氧化损伤的指标[19,20]。

1.3.7 数据分析

所有测定实验均重复至少三次，实验结果以平均值±标准偏差（SD）表示。数据通过IBM SPSS Statistics 19.0进行单因素方差分析，并以Duncans多重比较法进行显著性差异的分析，不同的字母表示了不同组别之间存在显著性差异（p<0.05）。

2 结果与分析

2.1 不同浓度辣木叶水提物对HepG2细胞存活率的影响

本实验中辣木叶水提物的制备采用超声辅助水提法进行制备。据报道，辣木叶水提物主要的活性成分为多酚和黄酮，其含量如表1所示，不同的提取条件会略有差异[21]。本实验采用MTT法来测定不同浓度的辣木叶水提物对细胞存活率的影响。实验中选取了不同浓度的辣木叶水提物（100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、500 μg/mL、600 μg/mL、800 μg/mL、1000 μg/mL），分别测定了其对HepG2细胞存活率的影响。由图1可以看出，与正常的细胞相比，低浓度辣木叶水提物HepG2细胞的存活率影响并不明显（对HepG2细胞的抑制率≤6%）；但在较高浓度时，即辣木叶水提物的浓度为800 μg/mL和1000 μg/mL时，HepG2细胞的存活率与对照组相比具有明显的下降趋势（p<0.05），此时细胞的存活率仅为86.80%和84.08%，对细胞的存活率有比较明显的抑制作用。因此，为了尽可能避免辣木叶水提物本身对细胞造成的毒性干扰作用，后续实验使用低浓度的辣木叶水提物（≤600 μg/mL）进行干预实验。

表1 辣木叶水提物的主要抗氧化活性成分[21]Table 1 The main antioxidant components of the aqueous extract of Moringa oleifera leaves[21]

图1 辣木叶水提物对HepG2细胞存活率的影响Fig.1 Effect of the aqueous extract of Moringa oleifera leaves on the viability of HepG2 cells

2.2 不同浓度H2O2对HepG2细胞增殖的影响

H2O2是一种重要的活性氧分子，它形成的超氧阴离子自由基能使细胞膜上的脂质物质和蛋白发生氧化反应，还能与胞内的铁离子反应生成·OH等自由基，造成细胞氧化应激状态和组织损伤，因此常作为体外氧化应激损伤的造模药物[22]。本实验通过添加0～800 μmol/L H2O2不同浓度的H2O2对HepG2细胞进行氧化损伤，筛选合适的H2O2剂量建立氧化损伤模型。由图2可知，加入H2O2后其对细胞造成明显的损伤，随着H2O2浓度的增加，HepG2细胞的存活率显著下降。尤其是在高浓度的H2O2（即800 μmol/L）作用下，细胞存活率只有空白对照组的21.00%。

在利用H2O2建立氧化损伤细胞模型中，过高浓度的H2O2对细胞造成会促使细胞发生不可逆转的损伤，不利于后期药物对其进行修复。因此，研究多数选择细胞半数抑制浓度附近的H2O2剂量来建立氧化损伤模型[23,24]。例如，Yi等人[25]发现H2O2对HepG2细胞半抑制浓度为500 μmol/L，后续实验利用500 μmol/L H2O2诱导建立氧化应激细胞模型。本次实验结果如图2所示，可计算出细胞半数抑制浓度为408.73 μmol/L，故后续实验选择使用浓度为400 μmol/L的H2O2对细胞进行处理建立氧化损伤模型。

图2 H2O2对HepG2细胞存活率的影响Fig.2 Effect of H2O2 on the viability of HepG2 cells

2.3 辣木叶水提物对氧化损伤HepG2细胞的保护作用

采用400 μmol/L的H2O2对HepG2细胞进行氧化损伤建模后，添加0～600 μg/mL不同浓度的辣木叶水提物进行干预实验，研究辣木叶对氧化损伤HepG2细胞的保护作用。如图3所示，与没有经400 μmol/L H2O2处理的空白对照组相比，用H2O2处理过的模型组细胞存活率显著降低（p<0.05）。在加入不同浓度的辣木叶水提物后，受氧化损伤的HepG2细胞存活率显著上升，且随着辣木水提物浓度的升高，细胞的存活率也逐渐升高。特别是当辣木叶水提物浓度达到500和600 μg/mL时，HepG2细胞存活率恢复到接近正常组的水平，存活率将近100%。

图3 辣木叶水提物对H2O2诱导HepG2细胞存活率的影响Fig.3 Effect of the aqueous extract of Moringa oleifera leaves on viability of HepG2 cells with damage induced by H2O2

细胞存活率是反映外界环境对细胞损伤程度的最直观指标。氧化应激的环境能导致胞内活性氧水平的升高，对HepG2细胞造成氧化损伤进而诱导细胞凋亡[26,27]。细胞存活率越高，说明HepG2细胞受到的氧化损伤越小。因此，细胞的存活率经常被用来反应天然活性成分的抗氧化能力。例如，Zhang等[22]发现大米蛋白水解物可将H2O2损伤细胞的存活率从50%提高到90%，说明该大米蛋白水解物具有较强的抗氧化活性。本研究中，对HepG2细胞添加100～600 μg/mL的辣木叶水提物进行预培养后，HepG2细胞存活率从50.12%提高到60%～99.51%。由此可知，一定浓度范围内的辣木叶水提物对H2O2诱导损伤的HepG2细胞有良好的保护作用，能缓解H2O2对HepG2细胞的氧化应激损伤。

2.4 辣木叶水提物对氧化损伤HepG2细胞内SOD的作用效果

SOD是一类具有特殊生理活性的物质，也是生物体内清除自由基的最主要的物质之一。SOD作为机体内清除自由基的第一道防线，主要清除细胞内的超氧阴离子自由基，催化其发生歧化反应，将超氧化物转化为H2O2和H2O，进而达到保护细胞免受自由基损伤的目的[28,29]。SOD在生物体内的水平高低也是反映生物体衰老与死亡的一个直观指标，其活力水平反应机体清除氧自由基的能力高低[30]。

结果如图4所示，与空白对照组细胞SOD活力（138.84 U/mg蛋白）相比，用400 μmol/L H2O2处理后的氧化应激模型组细胞的SOD活力下降明显（48.78 U/mg蛋白），下降幅度非常大。这表明该浓度下的H2O2能破坏细胞的氧化调节系统，降低胞内抗氧化酶系的活力，致使胞内的氧化动态平衡失衡，导致细胞发生不可逆的氧化损伤。同时，这也进一步证明本实验氧化应激细胞模型成功构建。与模型组相比，不同剂量的辣木叶水提物对细胞进行预培养后，能够显著地抑制H2O2所引起的细胞SOD含量的降低（p<0.05）。辣木叶水提物的加入，使细胞的SOD活力从模型组的48.78 U/mg蛋白升高至59.63～116.62 U/mg蛋白，提高幅度为22.24%～139.07%，且提高水平呈现剂量依赖关系。这表明辣木叶水提物能显著缓解H2O2所引起HepG2胞内SOD水平的降低，进而发挥抗氧化应激功能。

图4 辣木叶水提物对H2O2诱导HepG2细胞SOD活力的影响Fig.4 Effect of the aqueous extract of Moringa oleifera leaves on SOD activity in HepG2 cells induced by H2O2

2.5 辣木叶水提物对氧化损伤HepG2细胞内的GSH-Px活力的影响

GSH-Px是机体内重要的过氧化物分解酶，能催化GSH将H2O2等过氧化物还原成无毒的羟基化合物，从而保护细胞膜的结构和功能免受过氧化物的干扰和破坏[30,31]。GSH-Px的含量高低反映了细胞中自由基的数量多少：自由基含量越低，其对细胞的毒害作用就越小，机体受到的氧化损伤就越低[32]。

如图5所示，与正常对照组相比，加入H2O2后细胞的GSH-Px酶活性呈现显著下降（p<0.05），其酶活力值仅为正常对照组的50.42%。这表明该浓度下的H2O2对细胞造成了较为严重的氧化损伤，细胞内的抗氧化酶GSH-Px的活性被破坏。当采用不同浓度的辣木叶水提物对细胞进行预孵育处理后，细胞GSH-Px含量显著上升（p<0.05）。与模型组相比，不同浓度辣木叶水提物使细胞GSH-Px含量提高了20.77%～151.74%。此外，随着辣木叶水提物浓度的升高，GSH-Px的水平也越来越接近正常水平。这说明辣木叶水提物起可提高GSH-Px的活性，从而有利于催化GSH对氢过氧化物的还原反应，阻断体内脂质过氧化，保护细胞免受氧化损伤的作用。

图5 辣木叶水提物对H2O2诱导HepG2细胞GSH-Px活力的影响Fig.5 Effect of the aqueous extract of Moringa oleifera leaves on GSH-Px activity in HepG2 cells induced by H2O2

2.6 辣木叶水提物对H2O2诱导HepG2细胞MDA水平的影响

机体存在天然的氧化调控系统，在正常状态下能够抵抗一定程度的外界氧化应激刺激，维持机体氧化应激的动态平衡，从而避免外界对机体造成的氧化损伤[33]。但是，当氧化应激程度较为强烈，且机体的抗氧化系统不足以弥补时，细胞膜上不饱和脂肪酸首先会发生氧化反应。而MDA则是细胞膜上的脂类被氧化后所生成的重要代谢产物。它的产生可能会导致细胞代谢和功能障碍，甚至死亡[34,35]。MDA作为一种对机体有毒性和副作用的分子，其在细胞中的含量可以反映机体中脂质过氧化的程度，从而能够间接地反映细胞的氧化损伤程度[36,37]。因此，MDA的测定可用来对氧自由基介导的细胞损伤进行评价。

通过MDA试剂盒测定了辣木叶水提物对细胞内MDA含量的影响，结果如图6所示。H2O2处理的模型对照组细胞产生的MDA水平在所有组别细胞中是最高的，与空白对照组相比升高了108.11%（p<0.05），增幅非常明显。然而，当不同浓度的辣木叶水提物加入到细胞并经过预孵育处理后，细胞内的MDA水平相比于模型对照组有了显著的降低，其下降幅度为12.51%～34.04%，且呈现剂量效应。这表明HepG2细胞经H2O2处理后细胞膜发生了较严重的损伤，而辣木叶水提物能显著缓解活性氧对细胞膜脂质氧化损伤的影响，能减轻自由基对机体的氧化应激损伤，进而能提高机体对外界氧化应激的调控能力。这与之前辣木叶水提物能缓解H2O2所引起的细胞存活率降低、GSH-Px和SOD等酶类水平下降的结果相一致。

图6 辣木叶水提物对H2O2诱导HepG2细胞MDA浓度的影响Fig.6 Effect of the aqueous extract of Moringa oleifera leaves on MDA content in HepG2 cells induced by H2O2

目前，国内外学者均已通过体外化学方法分析了辣木叶水提物、醇提物以及乙酸乙酯提取物等不同方法提取物的抗氧化活性[38,39]。例如，国内学者陈庆钥等[40]利用超声波辅助提取辣木叶总黄酮并测定其DPPH自由基的清除能力，发现其具有较强的抗氧化活性，其清除DPPH自由基的能力随着浓度的升高而增强；国外学者Garcia-Beltran等[41]同样发现辣木叶水提物和醇提物均具有较强的自由基清除能力，且具有剂量依赖效应。本研究从细胞层面上，发现了辣木叶水提物具有较强的抗氧化活性，其抗氧化活性具有剂量依赖效应，与上述研究结果一致。辣木叶水提物中主要含有黄酮、多酚、多糖、蛋白质等成分[38]。其中，研究认为，辣木叶水提物中的抗氧化活性成分主要为多酚及黄酮[21]。因此，辣木叶水提物对H2O2诱导HepG2细胞损伤具有保护作用，可能的原因是其具有较为丰富的多酚及黄酮物质。

目前，在细胞氧化应激模型建立后，针对天然活性物质抗氧化能力的评价指标主要有细胞内主要抗氧化酶酶活力的变化（如SOD、GSH-Px、过氧化氢酶等）和非酶系统相关产物的含量变化（如MDA和GSH等）[42]。本实验发现辣木叶水提物可降低胞内MDA水平，提高GSH-Px和SOD等酶类的活性，表明辣木叶水提物可能通过减轻细胞膜脂质的氧化程度、提高胞内抗氧化物酶系的活力等途径提高机体的抗氧化能力，从而增强对外界氧化应激的调控。

3 结论

本实验以辣木叶水提物为研究对象，以H2O2诱导HepG2细胞构建氧化应激损伤模型，分别从细胞存活率、胞内MDA水平和抗氧化酶系活力等方面探讨辣木叶水提物对氧化应激损伤的修复作用。结果表明：辣木叶水提物能显著缓解H2O2引起的HepG2细胞存活率的降低和胞内MDA水平的升高，提高抗氧化酶GSH-Px和SOD的活力，从而提高细胞抗氧化能力。以上研究表明，辣木叶水提物具有较强的细胞抗氧化活性，这为后续辣木叶对细胞抗氧化的作用机制研究提供了基础，也为辣木叶抗氧化功能产品的开发提供理论依据。