颠茄种子质量检验方法研究

范 为， 熊维政， 董诚明， 李 磊， 郭 立， 冯言颜

(1.河南中医药大学， 郑州 450046； 2.河南羚锐制药股份有限公司， 河南 信阳 465550)

颠茄(AtropabelladonnaL.)又称“野山茄”“颠茄草”，是茄科(Solanaceae)颠茄属(AtropaL.)多年生草本，原产于欧洲地中海地区和小亚细亚，20世纪30年代引入我国[1]。颠茄味微苦、辛，有毒，主要有效成分为托烷类生物碱，具有镇痛、抗炎、活血等药理活性[2-3]。颠茄是我国药典规定的唯一托品烷类生物碱药源植物，颠茄草饮片在中医临床处方上使用较少,现常将颠茄草制备成流浸膏、浸膏、酊剂、片剂等成药制剂供临床使用[4]。

现阶段颠茄为种子繁殖，一年生栽培，全草采收。中药材种子质量关乎最终的产量与质量，颠茄草因其产地分布零散，标准化种植基地仍在建设中，缺乏基础性的生药研究，目前对颠茄的研究多集中在化学成分、毛状根等方面，国内至今未见关于颠茄种子质量的报道。本研究参考农作物种子检验规程[5]，对颠茄种子检验方法进行研究，以期为颠茄种子标准的制定提供依据，为颠茄草规范化种植基地的建设积累科研资料。

1 材料和方法

颠茄种子于2019年6月28日采自河南省新县浒湾乡河南羚锐制药中药材种植基地，经河南中医药大学董诚明教授鉴定为颠茄(AtropabelladonnaL.)的成熟干燥种子。

1.1 种子真实性鉴定[6]

随机取颠茄种子100粒，置于体式显微镜下观察种子表面性状特征[7]，并记录种子长、宽、厚的数值(mm)，重复3次。

1.2 扦 样

按照净度分析试验不能少于2 500粒种子、送检样品的重量超过净度分析量10倍的原则，用四分法分取样品进行试验[8]。

1.3 净度分析

考虑颠茄种子混杂的细小尘屑影响净度分析的准确性与可操作性，先将待分析的种子过20目筛，再进行净度分析。用镊子将杂质拣出并分别称重，重复3次，计算净度。

1.4 千粒重测定

千粒重量测定方法如下： 1) 百粒法：每组100粒种子，重复8次； 2) 五百粒法：每组500粒种子，重复6次； 3) 千粒法：每组1000粒种子，重复3次。每组种子分别称重(g)，结果精确到0.001 g，计算三种方法称量结果的平均值、标准差和变异系数。

1.5 水分测定

颠茄种子水分测定采用整粒低恒温烘干和整粒高恒温烘干2种方法进行试验。随机取2份净种子，每份约2 g，分别于(105±2)℃和(130±2)℃条件下烘干，重复3次。种子含水量计算公式如下：

种子含水量(%)=[(M2-M3)/(M2-M1)]×100%;

式中：M1为称量瓶质量，M2为称量瓶及样品烘干前质量，M3为称量瓶及样品烘干后质量。

1.6 生活力测定

采用TTC染色法，用pH 6.5～7.0的磷酸缓冲溶液将TTC配制成0.1%、0.3%、0.5%的溶液，避光保存。前期预试验发现颠茄种皮透水性较弱，整粒种子直接染色效果差，故将种子浸于常温蒸馏水中过夜[9]，用刀片将种子纵切，暴露胚或剥取胚，备留染色用。选取TTC浓度(A)、染色时间(B)、染色温度(C)为考察因素，每个因素选取三个水平，避光染色，以生活力为评价指标，用L9(33)安排试验，因素水平见表1[10]。每处理300粒种子，3次重复，每重复100粒种子。

表1 颠茄种子TTC染色法因素水平表

1.7 发芽试验

1.7.1发芽床的影响试验

设置纸上(设1～3层)、纸间、沙上、沙间四种发芽床，30 ℃恒温黑暗培养箱中发芽。各处理种子的试验量为100粒，3次重复。

1.7.2温度的影响试验

以2层滤纸做发芽床，于5、10、15、20、25、30、35 ℃恒温黑暗，15 ℃/25 ℃、20 ℃/30 ℃变温黑暗条件下进行发芽试验，各处理种子的试验量为100粒，3次重复。

1.7.3光照的影响试验

以2层滤纸做发芽床，于12 h光照/12 h黑暗和全黑暗，30 ℃恒温条件下进行发芽试验。各处理种子的试验量为100粒，3次重复。

2 结果与分析

2.1 颠茄种子性状

颠茄种子三角状肾形、椭圆形或卵形，长1.6～2.3 mm，宽1.0～1.8 mm,厚0.4～1.0 mm，灰黄色或深褐色，无光泽。表面具微凸的细网纹。背面宽圆，腹面近平截，种脐位于腹面微凸处，具绒毛。胚乳丰富，胚呈环状弯曲，乳白色(见图1)。

图1 颠茄种子特征图

2.2 扦 样

颠茄种子净度分析试样量大于3 g，送检样品量不少于30 g。

2.3 净度分析

颠茄种子净度分析结果见表2。3次重复的结果误差在5%以内，表明此分析方法准确可行。

表2 颠茄种子净度分析结果

2.4 千粒重测定结果

颠茄种子千粒重测定结果见表3。3种方法测定值的变异系数均小于4.0%，3种方法均可行。百粒法所需种子量少，因此颠茄种子千粒重量测定采用百粒法。

表3 颠茄种子千粒重测定结果

2.5 水分测定

颠茄种子水分测定结果见表4。整粒低恒温(105±2)℃烘干4 h后水分含量无显著性变化，整粒高恒温(130±2)℃烘干2 h后水分含量无显著性变化，且该方法测得的种子含水量较高，宜采用整粒高恒温(130±2)℃烘干2 h测定颠茄种子含水量。

表4 颠茄种子水分测定结果

2.6 生活力测定

颠茄种子生活力测定试验结果见表5，由试验极差R得出影响因素大小为TTC浓度>染色温度>染色时间。根据综合评分，按单指标方法做直观分析，得出TTC法测定颠茄种子生活力的最佳条件为A2B3C2，即纵切或剥取种子胚，在0.3%TTC溶液中30 ℃恒温黑暗条件下染色3 h(见图2)。

注：A～D为有生命活力的胚；E～H为无生命活力的胚。

表5 不同TTC浓度、染色时间、染色温度对颠茄种子生活力的影响

2.7 发芽率测定

2.7.1发芽床选择

不同发芽床对颠茄种子萌发的影响见表6，纸上、纸间、沙上、沙间发芽床对种子发芽率影响不显著(p>0.05)，纸上、沙上、沙间处理的发芽势显著高于纸间处理的发芽势(p<0.05)。出于经济和便捷考虑，把纸上作为颠茄种子的发芽床。

表6 不同发芽床对颠茄种子发芽率的影响

不同纸张层数(1～3层)对颠茄种子萌发的影响见表7，纸张层数对颠茄种子发芽率和发芽势影响不显著(p>0.05)，综合操作便捷性和保湿性能考虑，选用2层作为颠茄发芽的纸张层数。

表7 纸张层数对颠茄种子萌发的影响

2.7.2发芽温度确定

不同温度对颠茄种子萌发的影响见图3，种子在10、15、20、25、30、35 ℃恒温及15 ℃/25 ℃、20 ℃/30 ℃变温条件下终发芽率分别为0、24.00%、42.33%、63.67%、88.00%、47.00%、51.67%、86.00%发芽势分别为0、4.33%、35.67%、45.67%、57.67%、47.00%、29.67%、83.67%。种子在30 ℃与20 ℃/30 ℃变温条件下的终发芽率无显著性差异，且显著高于其他处理(p<0.05)。综合以上结果，颠茄种子发芽温度以30 ℃恒温和20 ℃/30 ℃变温条件最好，30 ℃恒温条件便于操作，建议在实际生产中应用。

图3 不同温度培养条件下颠茄种子发芽率的变化

2.7.3发芽光照选择

不同光照条件对颠茄种子萌发的影响见表8，颠茄种子在全黑暗条件下的发芽率和发芽势显著高于12 h光照/12 h黑暗的处理(p<0.05)，因此颠茄发芽宜在全黑暗条件下进行。

表8 光照条件对颠茄种子萌发的影响

2.7.4颠茄种子发芽首次和末次计数时间

在确定的最优条件发芽试验中，颠茄种子发芽起始时间为第5～6天 (图4)，发芽终止时间为第14天。因此颠茄种子发芽试验首末次计数时间为5～14 d。

图4 颠茄种子发芽形态

3 结论与讨论

本研究从净度、千粒重、含水量、生命活力、发芽率试验对颠茄种子质量进行了初步研究，适用于颠茄种子质量检验。目前，颠茄种子须由人工采收。在预实验中发现，少数种子籽粒瘦弱且种皮颜色较浅，这类种子发芽率极低，或者发芽完成的时间超过正常值，考虑这类种子成熟度不够，种皮颜色、种子大小与种子质量的联系需进一步研究[11]，颠茄植株的花序形态为二歧聚伞花序，进入花期后顶花序上的果实便开始成熟且生长时间长，成熟度高于植株顶端的果实，关于种子的采种时间与成熟度的划分方法的研究还有待进一步开展。

在进行水分测定预实验时，由于颠茄种子颗粒较小且胚乳中脂质成分较多，粉碎后的种子互相发生粘黏，使试验不可控因素增多，权衡试验可操作性与结果准确性，最终选择整粒法进行水分测定试验；此外，在颠茄种子生活力试验中，整粒种子直接染色效果较差，剥取种子胚具有不可操作性，将种子纵切进行染色效果较好；在发芽试验中考察了不同温度处理，结果表明，30 ℃恒温和20 ℃/30 ℃变温处理的种子发芽率最高，可达到85%以上。颠茄种子发芽完成的时间较长，而颠茄又存在最佳采收期的问题，建议实际育苗时可使用一些商品育苗基质[12]，以提高种苗质量，同时使其出苗一致，进而确保药材高产和质量稳定。此外，颠茄种子种皮透水性弱且较硬实，本实验发芽前采用50 ℃水浸种，搅拌冷却后再浸泡12 h作为发芽前的种子处理，种子处理方法还有待进一步考察。

2020年版《中国药典》规定颠茄草的采收期为“开花至结果期”，全草采收，本课题组通过产地调研发现，在实际生产中颠茄常经医药公司承包给农户种植，出于种植面积有限和留种的考虑，农户常将种子单独出售，破坏了全草的完整性，很难保证药材质量稳定，应加快推进颠茄草留种基地的建设。