基于CRISPR/Cas9技术的Wip1基因敲除ST细胞的建立

车晶晶，徐 奎，张秀玲，向光明，王 楠，王 悦，刘志国，牟玉莲，李 奎

(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193)

公猪繁殖能力直接影响母猪受胎率，同时也极大地影响后代仔猪与育肥猪的生长性能。睾丸作为雄性动物的主要生殖器官，其功能受“下丘脑-垂体-睾丸轴”调控，内含间质细胞、支持细胞、生精细胞和管周肌样细胞[1]。睾丸支持细胞分布在睾丸生精小管基底部，与生精细胞构成生精小管壁[2]。生精细胞在生精小管内规律、持续地产生精子，精子的正常发育等生理过程均需生精细胞与周边支持细胞的密切配合。支持细胞能够为生精细胞提供营养物质，促使精原干细胞分化，进而密切调控精子的发生过程[3-4]。生精细胞通过凋亡使其数量与支持细胞保持一定的比例，从而确保其能得到充分的营养，保持正常的生殖功能，即支持细胞的数量和功能控制着生精细胞的数量[5]。同时，支持细胞能通过调节生殖细胞的发育直接影响胚胎睾丸的形成和精子发生，从而控制着睾丸的大小和生精量[6-7]。猪睾丸(swine testis，ST)细胞是从猪胚胎(80～90日龄)睾丸组织中分离出的未成熟支持细胞，已被用于睾丸发育机制、猪病毒特征及致病性等方面的研究[8-10]。每个成熟的支持细胞只能维持一定数量的生殖细胞进行精子发生过程，且它的数量在体成熟之前就已经确定，只有未成熟的支持细胞(ST细胞)才会增殖，因此ST细胞对精子的发生至关重要[11]。

野生型p53诱导磷酸酶1(wild-type p53-induced phosphatase l)是一种丝/苏氨酸磷酸酶，由Ppm1d(protein phosphatase，Mg2+/Mn2+depen-dent 1 delta)基因编码[12]，位于猪的12号染色体上。Wip1蛋白序列在哺乳动物中高度保守，其中人、猪和鼠Wip1氨基酸相似度可达到84%。Wip1基因在体内广泛表达，是动物各种生物过程中的重要调控因子，在多个方面发挥着功能[13-15]。研究表明，Wip1可以通过调控靶分子的磷酸化，从而在细胞周期、凋亡和DNA损伤修复等方面发挥作用，其还在由应激反应引起的自噬和细胞凋亡过程中起着关键的调节作用[16-17]。最新研究发现，Wip1可选择性地结合Smad4蛋白使其Thr277位点去磷酸化，从而负调控TGF-β通路，进而调控哺乳动物细胞的生长和迁移[18]。此外，多项研究表明Wip1在繁殖方面也有重要的调节功能。Choi等[19]研究发现，Wip1基因敲除的雄鼠表现出了生殖器官的缺陷，免疫功能下降以及细胞周期紊乱。Filipponi和Cho等[20-21]研究也表明，Wip1基因敲除可引起ATM信号通路的激活、血睾屏障完整性受损和生殖细胞的异常发育，从而导致雄性动物生殖能力下降。

ST细胞对睾丸功能和精子发生发挥着重要调控作用，直接影响公猪繁殖性能，但目前在猪中关于Wip1基因对ST细胞的研究报道较少。因此，本研究拟采用CRISPR/Cas9编辑系统获得Wip1基因敲除的ST细胞，从而为研究Wip1基因对ST细胞增殖、凋亡以及对公猪繁殖能力的影响提供细胞模型。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 细胞和载体 ST细胞购自武汉博士德生物工程有限公司，pX330-GFP和pX330-RFP为实验室前期留存的质粒载体，感受态细胞为实验室保存的DH5α[22]。

1.1.2 主要试剂 细胞培养所需的DMEM、FBS、Pen-strep、Trypsin均购自Gibco；Basic Primary Fibroblasts Nucleofector Kit转染试剂盒购自Lonza公司；DNA提取试剂盒、RNA提取试剂盒、载体连接试剂盒、无内毒素质粒大提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；KOD FX DNA Polymerase购自宝林科(北京)生物科技有限公司；Clone Smarter TOPO-Omni-Amp购自中美泰和生物技术(北京)有限公司。

1.2 猪Wip1基因敲除载体构建

将实验室已有的靶向编辑猪Wip1基因第一外显子的两条sgRNA(sgWip1-1，sgWip1-2)分别连接到pX330-GFP和pX330-RFP载体上，分别命名为pX330-GFP-Wip1-g1和pX330-RFP-Wip1-g2。具体的构建步骤为：1)寡聚核苷酸(oligonucleotide, Oligo)合成和退火。根据sgWip1-1和sgWip1-2序列合成互补配对的Oligo并进行退火连接，连接体系为：正反链Oligo各1 μL，Solution I 5 μL和ddH2O 3 μL，98 ℃加热10 min，自然冷却至室温。2)质粒连接。载体骨架与退火的Oligo反应液按如下体系连接：质粒载体骨架1 μL，退火oligo反应液2 μL，Solution I 7 μL，室温反应5 min。3)重组质粒转化。将连接后的产物进行转化，并选取单菌落进行测序，测序引物为sq primer(5′-TGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAG-3′)。4)挑选正确序列的菌落，进行扩大培养，并用无内毒素大提质粒试剂盒提取pX330-GFP-Wip1-g1和pX330-RFP-Wip1-g2质粒，所提质粒用于细胞转染。

1.3 ST细胞培养与转染

转染前1 d复苏ST细胞，用含有10% FBS、1% Pen-strep的DMEM培养基培养，当细胞长到培养皿的80%时即可进行转染，按照Basic Primary Fibroblasts Nucleofector Kit(Lonza)试剂盒说明书进行电转，然后将转染的细胞转移至培养板，置于培养箱(37 ℃，5% CO2)中培养。转染后48 h观察ST细胞发光情况。

1.4 筛选双荧光阳性单克隆细胞

用PBS冲洗转染后48 h的ST细胞，收集消化的细胞，过滤后上机分选。以未转染的ST细胞作为空白对照，通过流式细胞仪收集GFP、RFP双荧光阳性细胞，进行扩大培养。

1.5 Wip1基因片段敲除效率检测

收集空白对照细胞、转染48 h后未分选的细胞和部分流式富集后的细胞进行DNA提取，然后进行PCR扩增，扩增引物为Wip1-F：5′-GCGGACAAGTCCCGACATCG-3′；Wip1-R：5′-CCCCG-AGACTTCGCCTCCAG-3′。PCR反应体系：KOD FX 0.4 μL，KOD Buffer 10 μL，dNTP 4 μL，Wip1-F 0.5 μL，Wip1-R 0.5 μL，DNA 2 μL，ddH2O 2.6 μL，共20 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性2 min；98 ℃ 变性10 s，68 ℃退火30 s，34个循环；72 ℃ 5 min。 PCR产物进行电泳，并用Image J软件进行灰度值测定，计算sgRNA编辑效率。

1.6 单克隆细胞的培养及基因型鉴定

将流式富集后的混池细胞进行稀释，每个10 cm 培养皿接种200个细胞，然后置于培养箱(37 ℃， 5% CO2)中培养，每3 d观察细胞形态并及时更换培养基。将单个细胞团进行标记，挑取单克隆细胞传代培养。待细胞长至80%时，将细胞消化下来，并取少量细胞提取基因组DNA进行PCR、测序鉴定，剩余细胞传至24孔培养板培养。鉴定PCR程序和体系同“1.5”，同时将PCR产物进行T-A克隆，选取单克隆菌落送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.7 数据统计分析

采用Image J软件分析电泳条带灰度并计算敲除效率，片段敲除效率=敲除条带灰度值/(敲除条带灰度值+未敲除条带灰度值)×100%；测序峰图用SnapGene软件进行分析。

2 结 果

2.1 ST细胞的转染效率检测

将构建好的pX330-GFP-Wip1-g1和pX330-RFP-Wip1-g2质粒载体共转染ST细胞，48 h后在倒置荧光显微镜下可以观察到部分细胞能够同时发出红色荧光和绿色荧光，说明pX330-GFP-Wip1-g1和pX330-RFP-Wip1-g2质粒载体已成功转入ST细胞(图1)。

A. 明场下转染后的ST细胞；B. ST细胞红色荧光表达情况；C. ST细胞绿色荧光表达情况；D. ST细胞红、绿色荧光的叠加图A. ST cells after transfection under bright field; B. The expression of RFP in ST cells; C. The expression of GFP in ST cells; D. Merge of GFP and RFP in ST cells图1 ST细胞转染效率检测Fig.1 Transfection efficiency in ST cells

2.2 双荧光阳性细胞的富集和筛选

将pX330-GFP-Wip1-g1和pX330-RFP-Wip1-g2质粒共转染ST细胞，48 h后流式分选，收集红绿双荧光强度最高的细胞，其占总细胞量的4.85%(图2)，用于后续敲除效率检测以及单克隆ST细胞筛选。

A. 空白对照细胞；B. 转染后48 h细胞；圆圈表示流式收集的双荧光细胞A. Blank control cells; B. Cells after 48 h of transfection; The cells in the circle represent double fluorescent cells collected by flow cytometry图2 双荧光细胞流式分选图Fig.2 Flow cytometry of double fluorescent cells

2.3 Wip1基因片段敲除效率检测

收集空白对照细胞、流式富集前后的混池细胞，提取DNA进行PCR扩增。结果显示，空白对照细胞只在351 bp处有1条带，流式富集前的细胞和流式富集后的细胞均有2条带(351 和313 bp处各有1条带)，该结果表明转染双gRNA后，Wip1基因发生了片段敲除，用Image J软件分析条带灰度值，结果显示富集后敲除效率(74.8%)为富集前(47.8%)的1.56倍(图3)。

M. DNA相对分子质量标准；1. 空白对照细胞；2. 转染后48 h流式富集前的细胞；3. 流式富集后的细胞M. 100 bp DNA marker; 1. Blank control ST cells; 2. The unsorted ST cells after 48 h transfection; 3. The sorted ST cells after flow cytometry图3 Wip1基因敲除效率的检测Fig.3 The knockout efficiency of Wip1 gene in ST cells

2.4 单克隆细胞基因型的PCR鉴定

本试验共筛选得到30个单克隆细胞，提取DNA进行PCR鉴定。鉴定结果表明，仅有1个单克隆ST细胞没有发生敲除，剩余细胞均发生片段敲除，Wip1基因敲除效率可达96.7%(29/30)；其中1、2、9、20、27号克隆电泳有2条带，说明单等位基因片段敲除的有5个克隆；24个克隆电泳出现1条带(313 bp处)，即双等位基因片段敲除克隆有24个(图4)。随后将所有单克隆细胞的PCR产物进行T-A克隆后测序，测序结果表明，纯合双等位基因片段敲除的有8个，杂合双等位基因片段敲除的有16个(图5)，双等位基因纯合敲除效率为26.7%(8/30)。

M. DNA相对分子质量标准；水. 阴性对照；21. 未发生敲除的单克隆细胞；1、2、9、20、27. 单等位基因片段敲除；3～8、10～19、 22～26、28～30. 双等位基因片段敲除M. 100 bp DNA marker; H2O. Negative control; 21. Monoclonal cell without knockout; 1, 2, 9, 20, 27. Monoallelic fragment knockout; 3-8, 10-19, 22-26, 28-30. Biallelic fragment knockout图4 单克隆细胞基因型PCR鉴定Fig.4 The genotype of monoclonal cells identified by PCR

3 讨 论

基因编辑技术是对靶基因进行编辑修饰的技术，已被广泛应用于农业及医学研究的各个领域[23-24]。CRISPR/Cas9技术凭其经济、便捷、高效等优势，已被广泛应用于挖掘基因功能、培育动植物新品系、构建多种疾病动物模型[25-26]，同时该技术在基因治疗上的可行性和有效性也被证实[27]。猪是一种重要的畜牧用物种，利用基因编辑技术可以改善猪肉品质、增强抗病能力；同时猪在器官组织结构、生理等方面与人类比较近似，基因编辑猪又可以用于新药检测、动物疾病模型制备以及作为供体用于器官移植等[28-29]。目前，CRISPR/Cas9技术在猪的抗病育种中已取得了很大的研究进展。Zheng等[30]在猪中敲入UCP1基因提高其体温调节能力；Huang等[31]在猪中定点敲入PBD-2基因，增加了PBD-2蛋白的表达，显著提高了猪的抗菌能力；本实验室最新研究制备的无外源标记的CD163和pAPN双等位基因编辑猪，能够抵抗猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪传染性胃肠炎病毒，显著降低对猪德尔塔冠状病毒的易感性，且不影响猪正常的生长发育、生产和繁殖性能[32]。

红色的碱基表示PAM序列，绿色的碱基表示gRNA序列Red bases represent the PAM sequences, green bases represent the gRNA sequences图5 部分单克隆细胞基因型Fig.5 The genotypes of partial monoclonal cell clones

Wip1属于PP2C蛋白磷酸酶家族，在各个组织中广泛表达，且在睾丸组织中高表达，与雄性动物的繁殖密切相关[12]。研究表明，Wip1基因敲除小鼠表现出生殖器官缺陷，进而影响雄性小鼠的繁殖能力，这些异常可能是由于Wip1缺失后，通过依赖于ATM/BRCA1蛋白的DNA甲基化使睾丸异染色质沉默，精蛋白的表达显著降低导致的[20]。本实验室前期利用蛋白质组学技术，在Wip1基因敲除小鼠睾丸中筛选出多个差异表达蛋白和磷酸化蛋白，发现大部分蛋白主要参与细胞粘附/紧密连接、凋亡过程、炎症反应、精子发生、精子运动及骨架组装与解聚等生物学过程。进一步研究发现，Wip1基因敲除降低了Occludin，ZO-1和N-cadherin蛋白的表达，损伤了血睾屏障的完整性，进而影响正常的精子发生过程，导致小鼠生殖能力下降[33]。在哺乳动物中，Wnt信号通路在胚胎发生期间的组织谱系分化、胚胎干细胞体外的维护与自我更新中发挥着重要作用[34-35]。研究报道,β-catenin蛋白主要在睾丸中表达，是睾丸组织生长成熟的必需因子，机体可以通过调控Wnt/β-catenin通路影响睾丸细胞的增殖过程[36]。Boyer等[37]在小鼠睾丸支持细胞中发现Wnt/β-catenin通路的持续激活，β-catenin蛋白大量表达，会使生精小管恶化，生殖细胞损失和睾丸萎缩，造成男性不育。还有研究发现，Wnt通路激活会影响支持细胞的分化或成熟，引起生殖障碍和支持细胞瘤等[38]。此外，Cho等[21]发现，在生殖细胞发育过程中Wip1使Nemo样激酶去磷酸化，增强了淋巴增强因子结合因子1与β-catenin的互作；且在小鼠细胞中发现Wip1缺失会抑制Oct4及生殖细胞特异性标志物Nanos3、Ddx4和Dnd1的表达活性，影响生殖细胞的发育，这表明了Wip1可能通过调控Wnt信号通路的活性影响生殖细胞发育。还有研究发现，p53、MAPK、Wnt信号通路可能与精子发生或繁殖有关[39]。但在猪中，Wip1在这些通路中的具体作用机制，以及其是否通过影响ST细胞增殖进而调节睾丸功能和精子发生还不清楚。

本试验主要利用CRISPR/Cas9技术靶向编辑ST细胞中Wip1基因第一外显子，分别构建了2个sgRNA载体，电转染ST细胞48 h后，利用流式细胞术收集双荧光标记的ST细胞，并筛选单克隆细胞株。经流式富集后的敲除效率是富集前的1.56倍， 极大的提高了筛选效率，这种富集方法对其它细胞的富集也有重要参考意义。测序结果表明，Wip1基因发生片段缺失的效率可达96.7%，Wip1双等位基因纯合敲除细胞株数占总单克隆细胞株数的26.7%，这些结果表明本试验实现了对Wip1基因高效的编辑。

4 结 论

本研究成功构建了Wip1基因敲除的ST细胞，不仅为后续研究Wip1基因对ST细胞增殖、凋亡的影响提供了细胞模型，也为研究Wip1基因对公猪繁殖性能的作用打下了基础。