沙棘果渣三萜酸富集、表征及其体外α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

苏晨玉， 胡 娜， 董 琦， 王洪伦，*

(1.中国科学院 西北高原生物研究所/藏药研究重点实验室， 青海 西宁 810008；2.青海省藏药研究重点实验室， 青海 西宁 810008； 3.中国科学院大学， 北京 100049)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)为胡颓子科(Elaeagnaceae)沙棘属(Hippophae)植物，具有耐干旱、耐盐碱、耐贫瘠性等特征[1-2]，并具有较高的营养价值和药用价值。沙棘含有黄酮类、三萜类、多糖和氨基酸等活性成分[3-4]，是一种药食同源植物，在《晶珠本草》《藏药志》等典籍中均有药用记载。同时沙棘作为原料生产的副食品在市场上深受消费者青睐，目前有沙棘酸奶、沙棘果醋、沙棘冰酒和沙棘咀嚼片等产品。现阶段对沙棘的研究主要集中于沙棘果和沙棘叶等方面[5-8]，对沙棘果加工过程中产生的大量沙棘果渣研究和利用较少，造成了资源的浪费[9]。据文献报道[10-12]，沙棘果渣中也含有丰富的生物活性成分，因此具有极高的研究价值。

通过高效液相色谱法可测定沙棘中含有的三萜酸类化合物类型[13]。三萜酸类化合物中，五环三萜酸以游离或苷类形式广泛存在于自然界，是沙棘中含量最丰富的一种次级代谢产物，分为乌苏烷型、齐墩果烷型、羽扇豆烷型和木栓烷型4种结构类型，代表化合物有熊果酸、科罗索酸、山楂酸、齐墩果酸和桦木酸[14]。五环三萜酸类化合物有广泛的药理和生物活性作用[15-17]，具有降血糖、护肝、抗肿瘤、抗炎及免疫调节等功效。枇杷叶和夏枯草等植物中所含的熊果酸、科罗索酸和齐墩果酸通过对糖原磷酸化酶的抑制作用来降低血糖水平并对α-葡萄糖苷酶表现出抑制活性[18-21]。沙棘果渣中三萜酸类化合物含量丰富，总三萜酸含量可达11.605 mg/g[22]，并且动物实验结果显示，沙棘果渣提取物对糖尿病大鼠表现出较好的疗效[23]。

针对沙棘果渣利用率较低的现状，本研究通过对沙棘果渣三萜酸进行富集，提高各组分中三萜酸的含量，对富集组分中三萜酸成分进行表征和含量测定，同时对其α-葡萄糖苷酶抑制活性进行评价，以期为沙棘果渣的进一步深度开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

沙棘果渣，青海康普生物科技股份有限公司；甲醇(色谱纯) ，德国Merck公司；制备分离用球形十八烷基键合硅胶填料(ODS- A- HG)，粒径50 μm、孔径12 nm，日本YMC公司；阿卡波糖，上海源叶科技有限公司；α-葡萄糖苷酶(酵母来源)，美国Sigma公司；对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)，上海阿拉丁试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

AcquityTMultra型高效液相色谱仪，美国Waters公司；Triple TOF5600+型飞行时间质谱(配有电喷雾离子源，ESI)，美国AB SCIEX公司；Eppendorf minispan型离心机，德国Eppendorf公司；EPOCH2型酶标仪，美国BioTek公司。

1.3 实验方法

1.3.1沙棘果渣三萜酸的提取

将干燥的沙棘果渣粉碎后，按料液比(kg/L)1∶10加入体积分数95%乙醇，加热回流提取3次，提取温度70 ℃，每次1.5 h，过滤后合并滤液。将滤液减压浓缩，即得沙棘果渣乙醇浸膏，-20 ℃冷冻保存。

1.3.2沙棘果渣三萜酸的富集

称取沙棘浸膏1.0 kg，加入2 L蒸馏水，60 ℃水浴加热溶解，静置沉淀后过滤，滤渣干燥后即得三萜酸粗提物。取干燥后的粗提物6.20 g，加入甲醇溶解后过滤，与ODS按照质量比1.0∶1.5拌样并干燥。装入减压玻璃柱，依次使用3～5倍柱体积的体积分数20%、60%、80%、100%甲醇和氯仿- 甲醇溶液(体积比90∶10)按照流动相极性由大到小进行梯度洗脱。收集各部分馏分，并浓缩，干燥后即得不同极性富集物。

1.3.3沙棘果渣三萜酸含量的测定

使用香草醛冰乙酸法测定三萜酸含量，以齐墩果酸为标准品在紫外波长547 nm下测定吸光度，绘制标准曲线，并计算各富集组分的三萜酸含量[24]。

分别称取干燥后的浸膏、粗提物、不同极性组分10.0 mg，加入少量甲醇溶解后，再加入无水乙醇定容至50 mL。每组进行3次平行实验，取0.5 mL样品溶液于具塞试管中，每种样品取6份，3份为实验组，3份为对照组，置于沸水浴挥干溶剂后，实验组与对照组均加入1.6 mL高氯酸，而后实验组加入质量分数5%的香草醛- 冰乙酸溶液0.4 mL，实验组和对照组均在70 ℃下反应15 min，最后实验组、对照组分别加入8.0 mL和8.4 mL冰乙酸终止反应，于547 nm处测定吸光度，根据回归方程计算三萜酸含量。

1.3.4HPLC-Q-TOF-MS/MS实验条件设定

1.3.4.1 液相条件

称取三萜酸含量最高的组分7.5 mg，1 mL甲醇- 水溶液(体积比80∶20)溶解后，过0.45 μm滤膜用于测试。色谱柱：Agilent SB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇- 水溶液(体积比85∶15)，等度洗脱，流速为0.8 mL/min，检测波长为210 nm，柱温为30 ℃。

1.3.4.2 质谱条件

负离子扫描模式，离子源温度550～600 ℃；离子源电压为4 500～5 500 V；扫描范围m/z100～1 500。

1.3.5α-葡萄糖苷酶抑制活性测定

参照文献[25]的方法并改良，实验分为空白组、对照组、样品组和样品空白组，各反应物按表1中的剂量加入96孔板，每组进行3次平行实验，将待测试剂、磷酸缓冲液和酶溶液混合均匀，在恒温振荡器中37 ℃保温10 min，加入50 μL 0.5 mmol/LpNPG溶液，充分混匀，于37 ℃反应10 min，最后加入50 μL 0.1 mol/L的Na2CO3溶液终止反应，在405 nm波长下测定吸光度，根据式(1)计算各组α-葡萄糖苷酶的抑制率及IC50。

(1)

式(1)中，AC为空白组吸光度，AB为对照组吸光度，AS为样品组吸光度，ASB为样品空白组吸光度。

1.4 数据处理

所有实验均重复3次，结果表示为平均值±标准差。差异显著性分析采用Graph Pad 8.0软件进行，绘图采用Origin 9.0软件。

表1 酶活性抑制实验设计Tab.1 Design of enzyme activity inhibition experiment

2 结果与分析

2.1 沙棘果渣三萜酸的富集与含量测定结果

通过ODS减压富集共得6个不同的极性组分，分别命名为F1～F6。其中，20%甲醇洗脱为F1组分；60%甲醇洗脱为F2组分；80%甲醇洗脱为F3组分；纯甲醇洗脱时，明显分为2个不同颜色的色带，其中首先被洗脱下来的色带为F4组分，最后被洗脱下来的色带为F5组分；氯仿- 甲醇洗脱得到的组分为F6。

以标准品质量浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程为y=2.835 8x-0.019，R2=0.998 8，由此计算沙棘果渣各极性组分总三萜酸的含量，如表2。经过富集共得三萜酸粗提物179.12 g，取6.20 g粗提物进行减压富集后，共得三萜酸含量较高的F3组分0.51 g，F4组分1.75 g，其三萜酸的质量分数分别为63.24%和75.01%，说明沙棘果渣中的三萜酸主要集中在低极性组分中，ODS减压富集可快速高效地将化合物按照不同极性进行富集，且具有较高的回收率，F4组分三萜酸回收率为51.30%。

表2 富集组分中三萜酸含量Tab.2 Triterpene acid contents in enriched components %

2.2 沙棘果渣富集组分F4的特征分析

由于F4组分三萜酸含量最高，故利用HPLC- Q- TOF- MS/MS对富集后的组分F4进行了分析，以明确其特征成分，其液相色谱和总离子流图分别如图1和图2。组分F4经过分析发现主要含有11种五环三萜类化合物，结果见表3。

图1 组分F4的HPLC分析Fig.1 HPLC analysis of component F4

根据Scifinder和Reaxy数据库检索，结合分子离子峰和二级质谱碎片离子峰，推测出化合物类型。化合物1的m/z487 (M-H)-m/z469(M-H2O)丰度值较高，对比结果为化合物2α,3β,24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸。对比文献[26]，化合物10和11为差向异构体齐墩果酸和熊果酸，齐墩果酸由于相邻2个甲基空间结构的影响，造成m/z439(M2-H2O)-m/z421 (M3-H2O)丰度值较高；而熊果酸和化合物5中m/z411 (M3-HCOOH)-m/z393 (M4-H2O)和m/z455 (M3-HCOOH)-m/z409(M4-H2O)丰度值较为突出。化合物4与10、5与11间相对分子质量相差16，且具有相同的裂解规律，因此，推测化合物4为山楂酸，化合物5为科罗索酸。化合物6～9比山楂酸相对分子质量增加了146，结合文献[27-30]和碎片峰信息可推测为香豆酰三萜酸，即化合物6～9分别为山楂酸和科罗索酸的衍生物。

图2 组分F4的总离子流图Fig.2 Total ion chromatogram of component F4

表3 HPLC- Q- TOF- MS/MS表征组分F4中的三萜酸

2.3 三萜酸提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性分析

不同极性组分对α-葡萄糖苷酶的IC50测定结果见表4。由表4可知，除组分F1抑制活性极显著低于阳性对照阿卡波糖外，沙棘果渣粗提物及组分F2～F6均对α-葡萄糖苷酶具有较好的抑制活性，且都极显著高于阳性对照组阿卡波糖。组分F4抑制活性最强，IC50仅为0.040 mg/mL；其次为组分F3，IC50为0.047 mg/mL。由于组分F1三萜酸含量远远低于其他组分，因此其抑制活性较差，IC50大于2.000 mg/mL。结果表明，不同组分对α-葡萄糖苷酶的抑制活性与三萜酸含量呈正相关。

表4 不同组分对α-葡萄糖苷酶活性的半抑制浓度Tab.4 Semi-inhibitory concentration of different components mg/mL

3 结 论

目前对三萜酸类化合物的富集多采用大孔树脂乙醇洗脱法。在纯化过程中多采用水溶液进行上样吸附，由于提取液成分复杂，化合物极性较小等原因，样品溶解性较差，容易造成树脂的污染和堵塞，因此，上样前需进行预处理，且上样浓度不能过大，导致富集效率较低[31-34]。本研究采用的ODS减压洗脱法与固相萃取有类似之处，二者均为减压条件下进行梯度洗脱。蒋红红[35]研究发现，固相萃取法对白头翁中的五环三萜皂苷类化合物的富集具有良好的回收率。ODS减压洗脱法采用拌样吸附进行干法上样，改善了样品溶解性较差的问题，并且增大了上样量，ODS法的上样量远远大于固相萃取法，再通过甲醇- 水溶液进行梯度洗脱，实现了不同极性组分的分离与富集。同时，该方法具有良好的稳定性和重复利用性。结果表明：ODS减压洗脱法富集后，F4组分三萜酸质量分数提高到了75.01%，且具有较高的回收率，达到51.30%。同时结合液- 质联用色谱分析对F4组分所含三萜酸成分进行表征，结果显示：F4组分含有11种五环三萜类化合物，表明ODS减压洗脱法对极性较小的五环三萜类化合物具有良好的富集效果。

研究发现：植物中的三萜酸类成分对α-葡萄糖苷酶具有较好的抑制活性，其中熊果酸对α-葡萄糖苷酶有显著的抑制活性，其IC50仅为0.76 μg/mL，科罗索酸和齐墩果酸的IC50分别为1.14、1.27 μg/mL[36-37]，因此，推测F4组分中的熊果酸、科罗索酸和齐墩果酸这3种五环三萜对α-葡萄糖苷酶活性的抑制发挥了主要的作用。本研究通过一步步提高富集组分三萜酸含量，并进行不同组分对α-葡萄糖苷酶的抑制实验，发现随着三萜酸含量的提高，富集组分对α-葡萄糖苷酶的抑制作用也随之增强，且显著高于药物对照组阿卡波糖，表明三萜酸类化合物具有降低糖尿病人餐后血糖的潜在活性。