刘常青,苏雨苗,陈丽宜,宋力飞
(广州泽力医药科技有限公司,广东 广州 510700)
沙田柚Citrus grandis(L.)Osbeck cv. Shatian属于芸香科、柑橘属,是我国柚类的名种之一,原产于广西容县沙田村,后广泛栽培于广西、广东、江西、湖南等地。沙田柚果实较大,果皮色泽金黄,形似梨或葫芦,果肉晶莹饱满,带有清新香气,汁水少,口感清甜爽脆[1-3]。沙田柚营养丰富,富含蛋白质、糖、有机酸、果胶、纤维素、维生素C等物质,还包含一些天然活性成分,主要有黄酮类,香豆素类,柠檬苦素类,挥发油等[4-17]。沙田柚及其提取物具有抗癌、抑菌、降血糖、抗氧化、止咳祛痰、降血脂和防止动脉粥样硬化、抗炎镇痛等生理功能[18-20]。柠檬苦素和柚皮苷作为柚子中的主要苦味物质,是引起柚子苦涩气味的主要成分之一,具有抗焦虑,抗癌,抑菌,降低胆固醇,抗病毒等生理活性,其抗癌活性已成为研究热点[21-23]。
沙田柚于民国初年引进广东梅州,目前梅州已成为中国最大的沙田柚生产基地,2018年柚子及其他柑橘类品种栽培面积60.08万亩,年产量为94万吨,其中柚子产量79万吨[24]。沙田柚产业迅速发展同时,品质退化、品种良莠不齐、病虫害日趋严重、化学农药大量使用、系统规范的栽培管理技术缺乏、成熟高效的采后保鲜与深加工工艺缺乏等问题也日益突出[25]。
和力智能低温高效提取技术(HHLSE)能在室温下对物料进行提取,很好地保留原药材的物质成分及风味,较好地保持最终产物的原特征[26-27]。HHLSE提取过程包括粉碎、提取、分离、精制、浓缩等相应工序。本试验用梅州沙田柚作为原材,经HHLSE提取柚肉提取液、柚肉膜浓缩液;并建立沙田柚柠檬苦素含量的检测方法,采用中国药典[28]“化橘红”项下方法检测柚皮苷含量。通过对比沙田柚原材、提取液及膜浓缩液中柠檬苦素、柚皮苷的含量,为该经济作物综合开发利用提供依据,为沙田柚产业的可持续发展提供一定的理论依据。
梅州沙田柚,产地为广东省梅州市五华县。
和力智能低温高效提取技术及成套设备(广州泽力医药科技有限公司);高效液相色谱仪(岛津 LC-10AT VP PLUS);TB-114电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);TU-1900 双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);Diamonsil C18(2)色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)。
柠檬苦素对照品(批号:200606,纯度≥98 %,北京仪化通标科技有限公司);柚皮苷对照品(批号:200802,纯度≥98 %,北京仪化通标科技有限公司);甲醇分析纯(批号:20201022,天津市富宇精细化工有限公司);乙腈色谱纯(批号:R141915,北京迪科马科技有限公司)。
2.1.1 色谱条件 Diamonsil C18(2)色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈-0.02 %磷酸溶液(42:58);流速:1.1 ml/min;柱温:30 ℃;进样量:10 μl;检测波长:205 nm。
2.1.2 溶液的制备
2.1.2.1 柠檬苦素对照品溶液的制备 精密称取柠檬苦素对照品5 mg置入5 ml量瓶,用甲醇超声溶解并稀释至刻度,摇匀即制得1.0 mg/ml对照品储备液;精密吸取0.5 ml 柠檬苦素对照品储备液,用甲醇稀释定容于10 ml量瓶,制成0.05 mg/ml对照品标准液。
2.1.2.2 供试品溶液的制备 将梅州沙田柚去皮、粉碎,取5 g细碎品,用甲醇超声提取并定容于50 ml量瓶,用0.45 μm滤膜滤过得柚肉原材供试品溶液;取柚肉原材20 kg,分别加纯水8倍、6倍进行提取,经HHLSE提取[27]后得到柚肉提取液、柚肉膜浓缩液,用0.45 μm滤膜滤过即得柚肉提取物供试品溶液。
2.1.3 测定波长的选择 取“2.2.1”项下所述对照品标准液,以甲醇作为溶剂空白,用紫外分光光度计在波长200~400 nm扫描,确定柠檬苦素最大吸收波长205 nm。
2.2.1 色谱条件 柚皮苷色谱检验条件参考中国药典[26]“化橘红”项下方法:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇-醋酸-水(35:4:61)为流动相;检测波长为283 nm。理论板数按柚皮苷峰计算应不低于1000。
2.2.2 柚皮苷对照品溶液的制备 按照中国药典[26]“化橘红”项下的方法进行柚皮苷对照品溶液的制备。取柚皮苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1 ml含60 μg溶液,即得。
2.2.3 供试品溶液的制备 同“2.1.2.2”项。
2.3.1 线性关系考察 精密吸取“2.2.1”项下的柠檬苦素对照品储备液,用甲醇分别稀释配制成0.002,0.005,0.02,0.05,0.1,0.5,1.0 mg/ml质量浓度的柠檬苦素对照品溶液,按照“2.1”项色谱条件测定。以测得峰面积为横坐标(X),相对进样的浓度为纵坐标(Y)绘制标准曲线,得柠檬苦素的回归方程。以S/N=3信噪比计,测定方法的最低检测浓度。结果:柠檬苦素的回归方程Y=2.635×10-7X-0.045,r=0.990,柠檬苦素在0.05~1 μg的范围内具有良好的线性关系,方法的最低检测限为0.5 ng。
2.3.2 精密度试验 取柠檬苦素对照品标准液,按照“2.1”项色谱条件连续进样5次,以测得柠檬苦素的峰面积A为指标,测得平均峰面积A为36543,相对标准偏差RSD为1.39 %,表明该方法精密度良好。
2.3.3 重现性试验 分别取同一批梅州沙田柚肉提取物,平行取样5份供试液,按照“2.1”项色谱条件进样10 μl测定,以测得峰面积A为指标,测得平均峰面积A为113663,计算相对标准偏差RSD为2.59 %,表明该方法的重现性良好。
2.3.4 稳定性试验 分别取同一批梅州沙田柚肉提取物,分别于0,2,4,6,8 h按照“2.1”项色谱条件进样10 μl测定,以测得峰面积A为指标,测得平均峰面积A为46449,计算相对标准偏差RSD为2.33 %,表明该方法稳定性良好。
2.3.5 加样回收试验 按照高、中、低3个浓度梯度,精密移取已知含量的柚肉提取物样品,加入不同量的柠檬苦素标准溶液,按照“2.1”项色谱条件重复测定3次,计算回收率,见表1。由表1可见,柠檬苦素的加样回收率为99.60 %~100.96 %,RSD为0.50 %~1.83 %。
表1 加样回收率实验结果(n=3)
取梅州沙田柚原材、提取液及膜浓缩液,按照“2.1”项色谱条件测定柠檬苦素含量,按照“2.2”项下检测方法测定柚皮苷含量。结果见表2~表3。
表2 沙田柚原材及提取物柠檬苦素的含量分析(n=3)
表3 沙田柚原材及提取物柚皮苷的含量分析(n=3)
本试验采用HHLSE提取梅州沙田柚果肉,得到柚肉提取液和膜浓缩液,采用高效液相色谱法检测样品柠檬苦素含量,建立了检测柚肉柠檬苦素的方法。方法学考察试验结果表明,此法具有良好的线性关系,精密度、重现性、稳定性及加样回收率良好,柠檬苦素分离度及峰型较好,可作为检测柚肉柠檬苦素的方法。
HHLSE提取过程包括粉碎、提取、分离、精制、浓缩等相应工序。试验结果表明,该提取工艺保留了沙田柚果肉中大部分的柠檬苦素、柚皮苷,提取率较高,同时作为一种低温瞬提技术,又能较好的保持柚肉原材的风味和营养物质,可作为一种低温、高效的提取柚肉柠檬苦素及柚皮苷的工艺技术。
梅州市作为金柚之乡,当前的金柚产业面临着从“中期控质”到“后期功能延伸”的关键环节[29-30]。目前国内外对沙田柚的研究主要集中在栽培管理技术,精深加工方面,精深加工产品主要在凉果领域,特别是以果皮精油和果胶为主,其他活性物质如水溶性多糖等也已经成为新的研究热点[31]。药用方面研究应用与产品则少之又少。本研究结果表明,柚肉中含有丰富的柠檬苦素、柚皮苷,可制成具有理气化痰功效的饮料,也可作为提取柠檬苦素、柚皮苷原料,这与魏华强[32]等研究结果一致。对梅州沙田柚进行综合利用研究,不但可提高企业的经济效益,还利于梅州沙田柚产业可持续发展的循环经济之路。