基于Wolff-Kishner-黄鸣龙法合成红火蚁告警信息素及其触角电位反应

王丽坤，黄 俊，章金明，李晓维，张治军，MUHAMMAD Hafeez，吕要斌，*

(浙江省农业科学院 a.农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室(筹)，浙江 杭州 310021； b.植物保护与微生物研究所，浙江省植物有害生物防控重点实验室——省部共建国家重点实验室培育基地，浙江 杭州 310021)

红火蚁(SolenopsisinvictaBuren)是一种重要的农林业害虫，也是世界自然保护联盟(International Union for Conservation of Nature，IUCN)收录的最具有破坏力的入侵生物之一[1]，目前已经入侵我国15个省份，造成严重危害。红火蚁不仅入侵能力强，扩散速度快，而且能对人畜造成极其严重的危害[2-4]。作为典型的社会性昆虫，红火蚁具有明显的等级分化和个体分工。一个成熟的红火蚁蚁巢由几万至几十万头大小工蚁、几百头有翅雌蚁和有翅雄蚁、1头或多头蚁后及未成年的个体(卵、幼虫与蛹)组成[5]，目前我国发现入侵红火蚁种群基本上为多蚁后型。红火蚁不同品级之间之所以能够保持高度有序的分工和分配，主要依靠相关腺体分泌的信息素物质，如杜氏腺(Dufour’s gland)产生跟踪信息素(trail pheromone)、下颌腺(mandibular gland)产生告警信息素(alarm pheromone)等[6-7]。

告警信息素指由昆虫释放并能引起同种个体釆取防御行为的化学物质，是社会性昆虫一项重要的信息素物质。红火蚁告警信息素的主要成分为2-乙基-3，6-二甲基吡嗪，该化合物能够引起红火蚁强烈的告警反应。研究表明，工蚁、雌蚁、雄蚁和蚁后均能产生告警信息素，在婚飞过程中，雄蚁、雌蚁告警信息素的含量也发生显著变化，因此，推测该化合物很可能参与红火蚁婚飞等过程[8-9]。此外，告警信息素还对红火蚁的重要天敌——寄生性蚤蝇有强烈的引诱作用[10-11]。然而，由于红火蚁告警信息素在昆虫体内含量极低，腺体成分复杂，难以直接分离纯化，且商品化的标准品为2-乙基-3，6-二甲基吡嗪(40%)和2-乙基-3，5-二甲基吡嗪(60%)的混合物[12-14]，因此极大地限制了红火蚁告警信息素的发展和应用。

Wolff-Kishner-黄鸣龙还原法是一个重要的有机反应，它是将羰基还原成为亚甲基的常用方法之一[15]，因此，本文基于该合成方法，通过一步反应获得2-乙基-3，6-二甲基吡嗪，利用气相色谱-质谱联用(GC-MS)和标准品对合成化合物进行结构鉴定，并通过触角电位仪(EAG)测定红火蚁工蚁对不同浓度2-乙基-3，6-二甲基吡嗪的反应。

1 材料与方法

1.1 供试红火蚁

红火蚁采集于浙江省永康市新楼村(东经120°22′28″，北纬28°85′71″)，将整个蚁巢挖回，室内经水滴法分离得到红火蚁，利用黄粉虫(Tenebriomolitor)饲养，每个蚁群每天饲喂3～4头黄粉虫。红火蚁采集、分离和饲养方法参照吕利华等[16]和孙延勇等[17]的方法。

1.2 供试试剂

1-(3，6-二甲基吡嗪-2-基)乙酮(95%)、水合肼(85%)和二聚乙二醇(AR)购自国药集团化学试剂有限公司(SCR®，上海)，氢氧化钾购自上海麦克林生化科技有限公司，2-乙基-3，5(6)-二甲基吡嗪(分析标准品，异构体混合物，纯度99%)购自阿拉丁生化科技股份有限公司(Aladdin®，上海)，其他所需试剂均购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(Sigma-Aldrich)，其中，乙酸乙酯为分析纯(AR)，正己烷为色谱纯(HPLC， 99%)。

1.3 红火蚁告警信息素合成

将1-(3，6-二甲基吡嗪-2-基)乙酮(180.1 mg，1.2 mmol·L-1)加入到溶有85%水合肼(357.2 mg，6 mmol·L-1)的二聚乙二醇(30 mL)溶液中，缓慢升温至150 ℃反应2 h，冷却至室温后加入氢氧化钾(269.3 mg，4.8 mmol·L-1)，逐渐加热至180 ℃，再回流反应4 h。薄层色谱(TLC)检测反应完全后，将反应体系冷却至室温，加入30 mL水。用乙酸乙酯萃取(20 mL×3)，合并有机相后经无水硫酸镁干燥、过滤和旋蒸后得到粗品，再经柱层析色谱(乙酸乙酯∶石油醚1∶20)分离得到淡黄色产物，收率为85%，经GC-MS和市售标准品对产物进行结构鉴定。反应路线如图2所示。

1.4 GC-MS分析

将化合物用正己烷(99%，色谱级)溶解，经气相色谱-质谱(GC-MS，SHIMADZU GC-MS-QP2010 Plus)对化合物进行分析。色谱柱Rxi-5ms(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；升温程序：起始温度50 ℃，10 ℃·min-1至150 ℃，25 ℃·min-1至250 ℃，保持5 min；进样量1 μL，不分流；载气为He(>99.999%)；离子源为EI，离子源温度200 ℃，进样口温度250 ℃；电子能量70 eV；扫描质量范围40～500m/z。

1.5 触角电位反应(EAG)

EAG测定方法参照Guan等[18]和Li等[19]。用手术刀切下红火蚁工蚁头部，切口端与充满Ringer’s电生理盐水的参比电极相连，触角的尖端连接记录电极。电极通过银-氯化银丝与信号放大器连接，信号通过探针检测(INR-II， Syntech®， the Netherlands)，利用EAG2000软件(Syntech®，the Netherlands)记录和分析数据。取10 μL待测样品，均匀涂抹在滤纸条上，放入巴斯德管中，平衡30 s后用于刺激红火蚁，观察电位的变化。为了保证所有的待测红火蚁工蚁在测试过程中的活性与数据的有效性，实验溶剂正己烷作空白对照，分别比较合成的告警信息素与市售的2-乙基-3，5(6)-二甲基吡嗪标准样品的触角电位反应，在待测样品测试之前和结束之后两个对照各测试一次，取平均结果。若测试之前，阳性样品反应过小，则另挑选强壮的工蚁测试。测试过程中，两种化合物各设置5个浓度，分别为0.001、0.01、0.1、1和10 mg·mL-1，每个浓度重复5次。测试时间频率是0.2 s，空气的流速为800～1 000 mL·min-1。为确保实验的准确性，第2次刺激与第1次刺激之间需要间隔1 min。

2 结果与分析

2.1 红火蚁告警信息素合成

通过Wolff-Kishner-黄鸣龙还原法，将1-(3，6-二甲基吡嗪-2-基)乙酮在强碱作用下还原成2-乙基-3，6-二甲基吡嗪，反应产物经GC-MS和标准品进行对比分析。从总离子流色谱图(TIC)可以看出(图3)，市售标准品有两个明显的峰，根据文献[20-21]和标准品产品信息可以确定保留时间6.28 min的化合物1为2-乙基-3，6-二甲基吡嗪，6.38min的化合物2为2-乙基-3，5-二甲基吡嗪。在相同色谱条件下对合成化合物进行GC-MS分析，在TIC图谱中合成化合物的保留时间为6.27 min，与标准品中化合物1相对应；进一步对合成化合物的分子离子峰及其碎片信息进行分析，分子量m/z135的碎片丰度为100%，因此可以判断出该峰为准分子离子峰，主要由分子失氢裂解形成，即[M-H]+峰；由准分子离子进一步裂解，通过失去CH3、CHN、CH3CN和CH3CH2CN后分别得到m/z 121、108、94、80的碎片(图4)。进一步利用标准品对合成化合物1进行定量分析，化合物1的纯度为90.2%。

2.2 合成红火蚁告警信息素 EAG分析

EAG实验结果如图5所示，标准品和合成化合物均能引起工蚁强烈的触角电位反应，随着浓度的增加红火蚁工蚁触角对化合物的反应逐渐增强，当剂量达到200 μg时反应最强。剂量为0.01、0.1、1、10和200 μg时，标准品和合成化合物之间没有显著差异(P>0.05)。然而，当样品剂量为100 μg时，标准品和合成化合物之间差异显著(P<0.05)。

3 讨论

Wolff-Kishner-黄鸣龙还原反应是有机化学中经典的有机人名反应之一，该方法是第一个以华人命名的有机化学反应[15]。本研究通过设计和相关检索，首次利用该还原法合成红火蚁告警信息素。在水合肼和强碱共热下，将1-(3，6-二甲基吡嗪-2-基)乙酮中的羰基还原成亚甲基，从而实现化合物2-乙基-3，6-二甲基吡嗪的合成。该反应简单易操作，原料易得，反应收率高，能够有效减少副反应的发生，且产物中不会有同分异构体2-乙基-3，5-二甲基吡嗪生成，大大降低了分离难度。

目前，已有多种方法合成2-乙基-3，6-二甲基吡嗪，如Bohman等[22]利用Minisci反应将2，5-二甲基吡嗪在强酸作用下发生取代反应生成2-乙基-3，6-二甲基吡嗪，然而该反应需要大量的浓硫酸和双氧水，且后处理调pH过程中会释放大量的热量，容易造成产物挥发或分解。该合成方法仅适用于微量反应，不适合工艺放大，难以获得大量产物。Adams等[23]利用美拉德反应(Maillard反应)合成2-乙基-3，6-二甲基吡嗪，然而，该方法制备得到的产物中会有较多的副产物生成，难以分离提纯，不易于得到较高纯度的目标产物。

告警信息素是由一种昆虫释放并能引起同种个体釆取防御行为的化学物质。这类信息素主要存在于群集性或社会性昆虫中。告警是蚂蚁一种非常明显的行为之一，当遇到外界的压力和威胁时，蚂蚁会释放告警信息素，给同伴发出警告信号。蚁巢会针对即将发生的危险部署工蚁及兵蚁做好相应的措施。目前已有大量关于红火蚁告警信息素及其类似物的相关报道，相关研究指出告警信息素及类似物能够引起红火蚁强烈的行为反应，如引诱、趋避和聚集等行为[18]。

此外，吡嗪类化合物广泛存在于蚂蚁中，是蚂蚁中重要的信息素类物质。如猛蚁下颌腺中含有大量吡嗪类化合物，其中2位为烷基取代的3，5-二甲基吡嗪类化合物最为丰富[24-25]；多种收获蚁(Pogonomyrmex)毒腺的主要成分均为烷基吡嗪类化合物，如2，5-二甲基吡嗪、2，3，5-三甲基吡嗪和3-乙基-2，5-二甲基吡嗪等[26]。2-乙基-3，6-二甲基吡嗪不仅是红火蚁的告警信息素，而且也广泛分布在其他蚂蚁中，起到相关信息传递和交流的作用，如2-乙基-3，6-二甲基吡嗪是P.barbatus、P.maricopa、P.occidentalis和P.rugosus4种收获蚁的招募信息素(recruitment pheromone)。

尽管本研究成功合成出红火蚁告警信息素，然而还需对告警信息素的作用机制及其田间活性进行分析和验证。通过利用告警信息素对红火蚁的特殊作用方式，结合红火蚁田间防治方法，探索出一种基于信息素的红火蚁田间监测和防治技术。