大学生尿液邻苯二甲酸酯水平与睡眠时型的关联

闻星，徐洪吕，伍晓艳，，陶舒曼，杨娅娟，盛杰，詹凯，齐云霞，刘雯雯，邹立巍，谢阳，李婷婷，陶芳标，

1.安徽医科大学 a.公共卫生学院儿少卫生与妇幼保健学系 b.出生人口健康教育部重点实验室 c.人口健康与优生安徽省重点实验室 d.国家卫生健康委配子及生殖道异常研究重点实验室，安徽 合肥 230032

2.安徽省农业科学院畜牧兽医研究所安徽省畜禽产品安全工程重点实验室，安徽 合肥 230032

昼夜节律紊乱是一种内源性生物钟与环境光、暗循环失调的状态［1］，常见的表现形式为睡眠紊乱，多项研究显示昼夜节律紊乱与儿童青少年的身心健康密切相关，如肥胖、心血管疾病、代谢功能异常、内分泌失调、抑郁等［2-3］。睡眠时型是评价昼夜节律的一种方法［4］。邻苯二甲酸酯（phthalic acid esters，PAEs）是一种环境内分泌干扰物，作为增塑剂广泛应用于个人护理产品、家居摆设、食品药品等包装材料中［5］，人群研究发现PAEs 暴露与睡眠紊乱如失眠、睡眠中断有关［6］，动物研究发现环境内分泌干扰物可引起动物昼夜活动模式改变，降低活动水平［7］。目前关于PAEs暴露与人群昼夜节律的研究较少。昼夜偏好在青春期启动时开始向“夜晚型”转变，在青春期结束时达到顶峰［8］。本研究拟以处于青春期晚期的大学生为研究对象，分析大学生尿液PAEs 代谢物与睡眠时型之间的关联。

1 对象与方法

1.1 研究对象

本研究在2019年10—11月对中国江西省上饶市1 所综合类学校和安徽省合肥市1 所医科类院校的学生进行了横断面调查，采用随机整群抽样的方法，以专业为抽样单位，抽取1 152 名调查对象进行问卷调查和采集尿样。回收问卷1 151 份，排除4 份无效问卷后，最终纳入有效问卷1 147 份，有效回收率为99.7%。收集晨尿样本721 份。纳入问卷信息完整和有尿液样本的713 人进行分析。在调查前所有参与者均签署了知情同意书。本研究获得安徽医科大学生物医学伦理委员会的批准（批号：20200965）。

1.2 方法

1.2.1 问卷调查研究对象分批次集中在教室中，通过手机扫描指定的二维码获取自编的大学生健康相关行为电子问卷，在调查人员说明填写要求后填写问卷，填写时间为20～30 min。调查内容包括一般人口学特征（年龄、性别、专业、父母文化程度等）、家庭经济状况（与周围同学相比，自评家庭经济状况）、最近一个月内吸烟和饮酒情况（有或无）、最近一个月内影响睡眠的因素（如吃夜宵、喝咖啡、喝茶等）的发生频率、体力活动水平（使用国际体力活动问卷［9］评估）。

1.2.2 睡眠时型评估采用清晨型与夜晚型量表（Morning and Evening Questionnaire-5，MEQ-5）调查研究对象的睡眠时型［10］。MEQ-5 由5 个条目所构成，总分范围为4～25 分，其中4～11 分为夜晚型、12～17 分为中间型、18～25分为清晨型［10］。清晨型指早睡早起，并且起床后保持精力充沛；相反，夜晚型指晚睡晚起，在起床后一段时间感觉疲倦，而在晚上发挥最佳状态；中间型介于两者之间；与清晨型相比，夜晚型的昼夜节律延迟2～12 h［11-12］。研究发现，MEQ-5 在不同年龄人群中均具有良好的效度和信度［13-14］。本研究中，该量表的Cronbach’sα系数为0.74。

1.2.3 尿样收集与检测将已经编号的试管和聚丙烯尿杯在采集尿样前1 d 分发给研究对象，次日清晨由调查人员前往学生宿舍回收装有晨尿的试管。晨尿经离心后用聚丙烯冻存管分装上清液，置于-80℃冷冻柜冷冻保存。检测时取冷冻储存的尿液，在室温下解冻，采用固相萃取法［15］前处理尿液中6 种PAEs 代谢物：邻苯二甲酸单甲酯（monomethyl phthalate，MMP）、邻苯二甲酸单乙酯（monoethyl phthalate，MEP）、邻苯二甲酸-单-（2-乙基-5-羟己基）酯［mono（2-ethyl-5-hydroxyhexyl）phthalate，MEHHP］、邻 苯二甲酸单丁酯（monobutyl phthalate，MBP）、邻苯二甲酸-单-（2-乙基-5-氧己基）酯［mono（2-ethyl-5-oxohexyl）phthalate，MEOHP］和邻苯二甲酸单（2-乙基己）酯（mono-2-ethylhexyl phthalate，MEHP）。使用高效液相色谱串联质谱法同时测量6 种PAEs 代谢物的浓度［16］，采用手持式折射计（ATAGO，日本）测量尿比重［17］。

1.3 质量控制

按照相同的标准统一培训调查员。大学生按照专业分别集中到教室，通过现场扫描二维码填写线上问卷，有问题及时解答；线上问卷设置一个学号只能填写一次；大学生独立填写问卷，不能互相讨论。调查人员通过问卷系统后台核对问卷信息的完整性和填写质量。

在采样、离心、分装、运输以及检测等各个环节严格遵循操作规范，避免环境污染。选用聚丙烯材质的尿杯采集样品，首先是因为聚丙烯尿杯中PAEs 含量较低；其次，尿中的酶没有水解PAEs 的能力，不影响PAEs 代谢物的检测；最后，用质谱级水重复采样过程，跟尿样一同采用尿管采集、离心和储存，上机检测未检出目标代谢物。在实验室中每一个步骤尽量由同一个人完成，减少实验误差。实验使用的玻璃制品清洗干净防止交叉污染。每天做质控样品检测反映实验的精密度，其日内、日间变异系数分别为1.9%～9.0%和1.3%～6.8%。在前处理过程中采用前加标回收率来评价实验的准确度，40、60、80 μg·L-1的前加标回收率为90.7%～114.9%。不同PAEs 代谢物的检出限（limit of detection，LOD）以仪器3 倍信噪比估算，LOD 为0.046～1.194 μg·L-1［18］。PAEs 代谢物水平低于LOD 时，分析计算时以LOD/2 表示。采用尿比重来校正个体尿液PAEs 代谢物浓度［19］，对校正后的浓度进行log10转换。

1.4 统计学分析

用EpiData 3.1 软件建立数据库，SPSS 23.0 软件进行数据分析。对6 种PAEs 代谢物浓度的分布进行描述性统计。非正态分布的数据用中位数和四分位数间距表示。采用卡方检验比较不同人口学特征研究对象之间的睡眠时型差异。根据三分位数，将PAEs 代谢物浓度分为低（＜P33.3）、中（P33.3～P66.7）和高（≥P66.7）水平组。将睡眠时型作为应变量，PAEs 代谢物浓度作为自变量，学校、家庭居住地、独生子女、父母文化程度、吸烟、饮酒、睡眠影响因素以及体力活动等混杂因素为分类变量，使用广义线性回归分析PAEs 代谢物与睡眠时型之间的关联，并按性别进行分层分析，同时做趋势性检验。其中睡眠时型的类型作为有序分类变量、PAEs 代谢物浓度作为连续性变量和分类变量分别纳入分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 大学生睡眠时型的分布特征

大学生夜晚型、中间型、清晨型睡眠时型的检出率分别8.0%、68.0%和24.0%。不同性别、专业、家庭居住地、独生子女以及体力活动水平分组大学生的睡眠时型分布差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 不同人口学特征的大学生睡眠时型分布［n（%）］Table 1 Distribution of chronotypes among college students with different demographic characteristics [n (%)]

2.2 大学生尿液PAEs 代谢物检出情况

大学生尿液中MMP、MEP、MEHHP、MBP、MEOHP、MEHP 的检出率分别为97.5%、97.9%、98.6%、98.6%、98.7%和80.5%，尿比重调整后质量浓度中位数分别为16.02、24.61、15.33、263.25、12.19、2.94 μg·L-1。见表2。

表2 大学生尿液PAEs代谢物质量浓度分布Table 2 Distribution of urinary phthalate metabolite concentrations among college students

2.3 大学生PAEs 代谢物与睡眠时型的关联

广义线性回归模型性别分层分析结果显示，女大学生PAEs 代谢物浓度与睡眠时型存在关联，男性中未发现此关联。在控制混杂变量后，女性MMP 与睡眠时型呈负向关联（OR=0.55，95%CI：0.33～0.89），MEHHP 与睡眠时型呈负向关联（OR=0.24，95%CI：0.06～0.93）。将PAEs代谢物浓度作为分类变量进行分析发现，与低水平组MMP比较，女性高水平组MMP与睡眠时型呈负向关联（OR=0.51，95%CI：0.28～0.92），且MMP趋势性分析结果有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 大学生PAEs代谢物与睡眠时型关联的广义线性回归模型分析Table 3 Relationships between phthalate metabolites and chronotypes among college students by generalized linear model

续表3

3 讨论

本研究中大学生6 种PAEs 代谢物在尿液中的检出率为80.5%～98.7%，表明研究对象普遍暴露于PAEs。国内外研究结果显示的PAEs 代谢物浓度并不一致，可能与检测方法或纳入人群不同有关，但多数研究结果均提示MBP、MEP 的暴露水平较高［20-22］。PAEs 与塑料制品的结合不稳定，容易迁移到环境中，从而导致人体的暴露［23］。

美国国家健康和营养检查调查（National Health and Nutrition Examination Surveys，NHANES）发现，PAEs代谢物与成年人夜间醒来有关，且多种内分泌干扰物与睡眠紊乱有关［24］。其内在机制目前尚不明确，有研究认为内分泌干扰物能够与雌激素受体结合，引起肥胖相关问题，间接导致睡眠紊乱［25］。睡眠紊乱是昼夜节律紊乱的一种常见表现形式，本研究用睡眠时型来评价昼夜节律，发现大学生清晨型的检出率（24.0%）高于夜晚型（8.0%）。然而在另一项美国大学生研究中，夜晚型的比例（28.6%）高于清晨型（12.7%）［26］。Haraden 等［27］针对美国儿童青少年的研究发现，清晨型与夜晚型的检出率接近，分别为10%和11%。睡眠时型的差异可能与研究地区、人群有关。本研究发现MMP 与女性夜晚型睡眠时型有关，未发现任何PAEs代谢物与男性睡眠时型相关。夜晚型作息与多种不良心理和身体健康结果有关［28-29］。

睡眠时型的影响因素很多。最近研究关注到内分泌干扰物与昼夜节律的关联，提示内分泌干扰物可能扰乱昼夜节律，引起昼夜活动模式改变［7，30］。有研究表明女童比男童更早进入青春期，青春期结束也更早［31］。在青春期启动时，睡眠相位由儿童时期早睡早起逐渐向晚睡晚起转变［8］。同时，大量研究发现PAEs暴露与女童青春发动时相提前有关［32-33］，促使女童较早进入青春期。昼夜活动模式的相位、振幅和周期由雌激素和雄激素调节［34］，PAEs 可能通过类雌激素作用调控昼夜节律［35］，或者通过刺激下丘脑促性腺激素释放，调节青春期发生发展，从而间接调控昼夜节律［36］，促使女童较早向夜晚型睡眠时型转变。昼夜节律的产生与转录-翻译反馈循环有关，此循环受到一系列基因或蛋白质调控，包括钟基因（circadian locomotor output cycles kaput，Clock）、脑和肌肉芳香烃受体核转运样蛋白1 基因（brain and muscle ARNTlike 1，Bmal1）、隐色素基因（cryptochrome，Cry）和周期基因（period，Per）［37］。动物研究结果发现，PAEs 代谢物可直接上调雌鼠子代下丘脑视交叉上核的Clock、Per1基因的表达，从而调控雌鼠昼夜节律［38］。在斑马鱼研究中发现，暴露于内分泌干扰物双酚A 和雌二醇后，斑马鱼昼夜节律均发生改变，雌二醇暴露后还观察到斑马鱼活动模式发生改变［30］。

本研究检测了大学生尿液中多种PAEs 代谢物，结果具有良好的准确度和精确度；并且，本研究首次报告了大学生PAEs 暴露与睡眠时型的关联。然而，研究也存在局限性：首先，本研究只采集了单个时点的尿液样本，因为PAEs 生物半衰期短，几乎在24 h 内完全代谢［39］，所以不能代表每日接触PAEs 的平均水平；其次，本研究采用自填问卷的方式评价睡眠时型，可能无法避免报告偏倚；此外，睡眠时型的影响因素很多，虽然本研究将一些可能影响睡眠时型的因素纳入分析，但不能排除还有其他混杂因素未纳入研究而可能造成偏倚；本研究为横断面研究，未来需要开展纵向研究来验证PAEs 暴露对睡眠时型的影响以及性别差异，并且还需开展实验研究了解其生物学机制。

综上，大学生普遍暴露于多种PAEs，MMP 暴露与女大学生夜晚型睡眠时型有关。