鲜蒜贮藏期主要病原菌分离鉴定及臭氧抑菌效果研究

兰 璞，纪海鹏，贾 凝，张 娜，于晋泽，董成虎,3,*

（1.天津市农业科学院，天津 300384；2.天津市农业科学院农产品保鲜与加工技术研究所（国家农产品保鲜工

程技术研究中心（天津）），农业农村部农产品贮藏保鲜重点实验室，天津市农产品采后生理与贮藏保鲜重点实验室，天津 300384；3.天津市兴有果蔬种植专业合作社，天津 301714）

大蒜（AlliumsativumL.）也称为蒜头、大蒜头、胡蒜，是蒜类植物的统称[1]，为半年生草本植物，属百合科葱属，以鳞茎入药。从古至今埃及、中国、日本等一直用大蒜治疗多种疾病。大蒜是秦汉时从西域传入我国，经人工栽培繁育，具有抗癌功效，深受大众喜食[2]。大蒜呈扁球形或短圆锥形，外层是灰白色或淡棕色膜质鳞皮，剥去鳞叶，内有6～10个蒜瓣，轮生于花茎的周围，茎基部盘状，生有多数须根，有浓烈的蒜臭，味辛辣，有刺激性气味，可食用或供调味。目前我国大蒜主要栽培品种有：山东苍山大蒜品种群、吉林白马芽、山东金乡白蒜、江苏太仓白蒜、陕西蔡家坡紫皮蒜、黑龙江阿城大蒜、天津宝坻大蒜等。本研究所选试材为天津宝坻大蒜，以6瓣为主，蒜瓣在茎盘上围成一轮，蒜皮为紫红色，蒜瓣洁白、均匀，鲜嫩多汁，口感辛辣，脆香浓郁，肉质肥厚[3]。大蒜传统的贮藏方法有挂藏法、堆藏法、埋藏法、辐射贮藏和化学药剂处理贮藏[4]。目前市场上流通的大蒜主要是干蒜，源于其耐贮性。事实上新鲜大蒜口感更为鲜美，适于鲜食，但不易保存，在贮运过程中易受微生物污染，导致蒜瓣失水干缩、腐败发芽、易霉化软烂等问题发生，使鲜蒜的品质和商品价值受到影响。

目前果蔬的贮藏保鲜方法主要有低温、臭氧、1-甲基环丙烯（1-Methylcyclopropene，1-MCP）、涂膜、烟雾剂保鲜等。曹琳等[5]研究表明：臭氧处理大蒜可有效抑制赤霉、橘青霉等的生长发育，改变菌体形态。张静林等[6]采用30 mg/m3臭氧对脱水蒜片进行处理，发现蒜片中菌落总数得到显著抑制，且不影响蒜片内的营养成分。姜楠等[7]发现采用臭氧处理后的交链孢菌对生物活性的不良影响显著降低，同时发现适宜浓度的臭氧处理能够降解交链孢菌的多种芽孢菌，使得毒力得以显着降低。臭氧由于具有强氧化性且使用后无残留，被广泛应用于食品加工车间食品表面杀菌、防腐保鲜等多个领域[8]。臭氧处理果蔬，既有可靠的杀菌保鲜效果，又没有任何有害残留[9-10]。冷藏或气调贮藏配合臭氧处理是一项新型的果蔬保鲜方式[11]。根据臭氧在果蔬贮藏的研究报道，明确得到的结论是随贮藏库温度升高或相对湿度增加，臭氧的分解速率明显加快[12]。每年的冬季市面上大多为干蒜，鲜有可口的鲜蒜，因此本研究主要以贮藏5个月的宝坻鲜蒜为试材，进一步探索验证贮藏后期鲜蒜的主要致病微生物和致病微生物控制方法，以期获得新鲜的大蒜病害控制技术，满足广大消费者对鲜蒜食用需求。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

材料：贮藏后期的宝坻鲜蒜，于2019年5月购买，鲜蒜购买时含水量为64～66 g/100 g。挑选整理后用长1 m、宽0.6 m、厚度0.05 mm的鲜蒜专用PE袋包装，每袋15 kg置于冷库的架子上，贮藏温度（0±0.5）℃，相对湿度（RH）90%～95%，至2019年12月之后开始出现轻微发霉现象，挑选表面已霉变或产生霉变趋势，甚至生长出病原菌的鲜蒜进行致病微生物的分离鉴定，对分离的菌株进行鲜蒜反接种及分离纯化，并采用臭氧处理进行鲜蒜主要致病菌的抑制试验。

琼脂粉，北京奥博星生物化学试剂科技有限公司产品；葡萄糖，天津市科威有限公司产品；土豆，购于天津市西青区物美超市。

1.1.2 仪器与设备

VS-1300-V型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；LDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；SPX-250B智能生化培养箱，上海琅玕实验设备有限公司；气调冷库，意大利Isolcell公司；557115游标卡尺，艾威博尔研发制造有限公司；BX51TF摄像显微镜，日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 培养基的配制

采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基）培养大蒜的病害组织，即去皮马铃薯200 g，琼脂15～20 g，葡萄糖20 g，超纯水1 000 mL。

1.2.2 大蒜病原真菌的分离流程

冷藏条件下获取发病大蒜→无菌环境下分离大蒜病害组织→PDA培养基培养病害组织→镜检→培养基上多次纯化→获得单菌落菌株→镜检→确定病原菌[13-14]

1.2.3 大蒜病原真菌菌落形态观察及分离鉴定

观察分离培养基平板上菌落的形态，包括形状、色泽、大小、菌丝特征[15-16]；将单菌落的病原菌制片后无需染色直接在4倍、10倍、20倍和40倍目镜下观察菌丝形态和孢子形状，记录观察结果并拍照[17]；分离纯化后的菌种经过反接种试验来确定其致病性，如果发病症状与贮藏中的腐烂症状相同[18-19]，作为采后病害病原菌进一步鉴定到属种，分离鉴定方法参照《真菌鉴定手册》等书籍[20-23]。

1.2.4 主要病原菌回接与臭氧处理

在无菌环境下切分发病鲜蒜病斑与健康组织交界处（1 cm×1 cm）后置于PDA培养基上，随后放入培养箱中，设定培养箱环境为25℃。在已培养好的平板上打孔取菌饼，将菌饼置于新培养基中央继续培养，重复3次后得到纯化病原菌，采用菌液法[22]制备孢子悬浮液。

将主要病原菌侵染回接至已消毒的健康鲜蒜上，采用刺伤接种法[14]，使用无菌针在鲜蒜赤道部位制造伤口（大小约为4 mm×4 mm），将10μL孢子液注入伤口，被接种的鲜蒜贮藏在不同温度（0、25℃）条件下通过不同浓度（17.152、21.44 mg/m3）的臭氧气体熏蒸处理，每天进行不同时间（12、18 h）臭氧处理，共贮藏7 d。

每天随机取样，采用“十字交叉法”测量鲜蒜表面菌落的直径，每次取各处理组10个鲜蒜进行测定，每次测定重复3次。选择25℃旨在模拟室温货架温度，同时将不同温度下不作其他处理的接种大蒜作为空白对照组（CK）[24-25]。

1.2.5 数据处理

使用Excel 2016软件处理数据与作图，使用SPSS 20.0软件用Duncan检验进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 鲜蒜病原菌菌落细胞形态特征观察及鉴定

在本试验的冷藏条件下贮藏半年后，鲜蒜表面出现病斑。分离出鲜蒜的病变组织，并用PDA培养基培养。在显微镜下观察后，通过划线法分离，经过多次纯化后，得出单菌落菌株，分别镜检，确定鲜蒜的病原菌。

如图1A所示，分生孢子呈纺锤状或倒棒状，顶端延长成喙状，多细胞，有壁砖状分隔，分生孢子常数个成链。根据菌落细胞的形态特征，确定为交链孢纲中的交链孢属（Alternaria），容易引起新鲜大蒜发生黑斑病[26-27]。

图1 3种致病真菌形态特征Fig.1 Morphological characteristics of three pathogenic fungi

如图1B所示，菌丝顶端分枝形如扫帚，有横隔，其分生孢子梗经多次分枝，产生几轮对称或不对称的小梗，分生孢子呈球形、椭圆形或短柱形，光滑或粗糙。根据菌落细胞的形态特征，确定为半知菌亚门丝孢中的产黄青霉（Penicilliumchrysogenum），易引起大蒜发生黄青霉病[13]。

如图1C所示，分生孢子梗直立、透明、光滑，分生孢子透明、光滑，多数长圆形，亦有拟椭圆形、卵圆形或不规则长圆形孢子，或多或少呈平行的，或不同角度的倾斜排列。根据菌落细胞形态特征，确定为青霉属中的斜链拟青霉（PaecilomycescateniobliquusLiang），易引起大蒜黑霉病[13,25]。

通过鲜蒜致病微生物分离鉴定出的致病菌，结合贮藏后期鲜蒜发病情况统计得出其发病指数，发现冷库贮藏鲜蒜中交链孢霉的发病率最高，为69.3%，而观测发现致病菌产黄青霉、斜链拟青霉在低温冷藏条件下的发病率较低，分别为24.7%和17.9%，即控制交链孢霉的生长能够影响库内大部分鲜蒜霉变，且臭氧抑制交链孢属效果已有研究表明有效[5]。为此本研究以分离纯化的交链孢霉在不同臭氧处理条件下的生长情况作比较分析，通过测量菌落在臭氧处理后的环境中生长大小的直径判定臭氧对其控制作用。

2.2 臭氧抑制鲜蒜贮藏期交链孢霉的研究

2.2.1 0℃下不同浓度臭氧处理12 h对鲜蒜贮藏期交链孢霉生长的影响

由图2可见，在0℃下，随着贮藏时间的延长，鲜蒜表面的菌落直径呈增大的变化趋势。整个贮藏期内，空白对照组菌落直径始终显著高于臭氧处理组（P＜0.05）。可见与同温度下未经处理的空白对照组相比，臭氧浓度为17.152 mg/m3和21.44 mg/m3下处理12 h的交链孢霉生长速度得到了明显的抑制，且21.44 mg/m3臭氧处理组比17.152 mg/m3臭氧处理组的菌落直径更小。所以在相同温度（0℃）和处理时间（12 h）下，臭氧处理的浓度越大，菌落生长更为缓慢，抑菌效果更好，且证实了0℃下臭氧处理对交链孢霉的生长具有明显的抑制作用。

图2 0℃下不同浓度臭氧处理12 h对鲜蒜接种交链孢霉菌落直径的影响Fig.2 Effects of ozone treatments with different concentrations at 0℃for 12 h on the colony diameters of Alternaria inoculated in fresh garlic

2.2.2 0℃下不同浓度臭氧处理18 h对鲜蒜贮藏期交链孢霉生长的影响

如图3所示，在0℃下，空白对照组和臭氧处理组鲜蒜表面菌落直径在整个贮藏过程中均呈上升趋势。其中，对照组在整个贮藏过程中菌落直径显著高于臭氧处理组（P＜0.05），可见与同温度下未经处理的空白对照组比较，在臭氧浓度为17.152 mg/m3和21.44 mg/m3下处理18 h的菌落生长速度得到了明显的抑制。且在相同温度（0℃）和处理时间（18 h）下，21.44 mg/m3比17.152 mg/m3臭氧浓度处理菌落生长更为缓慢，抑菌效果更好。证实了在0℃下臭氧处理对交链孢霉的生长有明显的抑制作用。

图3 0℃下不同浓度臭氧处理18 h对鲜蒜接种交链孢霉菌落直径的影响Fig.3 Effects of ozone treatments with different concentrations at 0℃for 18 h on the colony diameters of Alternaria inoculated in fresh garlic

2.2.3 25℃下不同浓度臭氧处理12 h对鲜蒜贮藏期交链孢霉生长的影响

由图4可以看出，自接种第3天后，17.152 mg/m3组的菌落直径与空白对照组出现差异，而21.44 mg/m3组于接种第2天后差异逐渐明显。与同温度下未经处理的空白对照组相比，臭氧浓度为17.152 mg/m3和21.44 mg/m3处理12 h下交链孢霉的生长速度得到了明显的抑制。25℃贮藏温度下，接种5 d后菌落迅速布满果实表面，同时菌落创面软化塌陷严重，已无法继续观测，故不再进行量取。贮藏3 d后在相同温度（25℃）和处理时间（12 h）下，17.152 mg/m3臭氧处理组比21.44 mg/m3组菌落直径小，可见17.152 mg/m3臭氧处理组比21.44 mg/m3处理组抑菌效果更为有效。

图4 25℃下不同浓度臭氧处理12 h对鲜蒜接种交链孢霉菌落直径的影响Fig.4 Effects of ozone treatments with different concentrations at 25℃for 12 h on the colony diameters of Alternaria inoculated in fresh garlic

2.2.4 25℃下不同浓度臭氧处理18 h对鲜蒜贮藏期交链孢霉生长的影响

由图5可以看出，在25℃下，臭氧浓度为21.44 mg/m3处理18 h与同温度下未经处理的空白对照组菌落生长情况基本一致，并未出现较明显的抑制作用。同时，21.44 mg/m3臭氧处理组菌落直径与对照组之间差异较小。而17.152 mg/m3臭氧处理组贮藏第2、4、5天的菌落直径显著低于其他两组（P＜0.05）。证实臭氧熏蒸处理能抑制鲜蒜表面病斑直径的扩大，最终观测菌落直径发现无论是在0℃下还是25℃下，17.152 mg/m3臭氧都对交链孢霉产生了抑制作用，而且这种抑制在0℃下更为明显。

图5 25℃下不同浓度臭氧处理18 h对鲜蒜接种交链孢霉菌落直径的影响Fig.5 Effects of ozone treatments with different concentrations at 25℃for 18 h on the colony diameters of Alternaria inoculated in fresh garlic

3 结论与讨论

由于臭氧只作用在鲜蒜表面，因此贮藏室内存放的鲜蒜之间必须留有一定的间隙，使臭氧充分发挥作用。臭氧处理作为一种杀菌保鲜方法[28]，也有其局限性，表现在以下几方面：一是当果蔬处于密封包装情况下，冷库使用臭氧保鲜机保鲜时效果并不太理想；二是由于高浓度臭氧对人的眼睛、皮肤、呼吸道具有极强的刺激作用[29]，所以贮藏室的消毒应在无人的情况下进行；三是臭氧浓度并不是越高越好，臭氧使用浓度太大，会引起果蔬表面质膜损害，使其透性增大、细胞内物质外渗，导致品质下降，甚至加速果蔬的衰老和腐败等[30]。

本试验从0℃下贮藏后期鲜蒜上分离鉴定出3种致病菌，分别为交链孢属（Alternaria）、产黄青霉（Penicilliumchrysogenum）和斜链拟青霉（Paccilomyces cateniobliquusLiang），且根据发病情况确定交链孢霉是贮藏期鲜蒜的主要致病菌。在0℃下，21.44 mg/m3臭氧处理抑制交链孢霉生长比17.152 mg/m3臭氧处理更加明显；而在25℃下，17.152 mg/m3臭氧处理组却比21.44 mg/m3组抑制效果好。当处理环境温度相同，臭氧处理浓度也相同的情况下，处理12 h比处理18 h对霉菌的生长速度抑制效果要好。且在臭氧浓度相同、处理时间也相同的情况下，0℃组比25℃组交链孢霉生长情况得到更加明显的抑制。可见，温度对鲜蒜上交链孢霉抑菌效果的影响很大。本试验结果显示，0℃下21.44 mg/m3臭氧处理12 h对鲜蒜中主要病原菌交链孢霉的抑菌效果最好。