钙调节羊草非生物胁迫耐受性的作用

赵 曼，祁 智

(1.内蒙古大学 生命科学学院，牧草与特色作物生物学教育部重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010010；2.省部共建草原家畜生殖调控与繁育国家重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010010)

羊草(Leymuschinensis)别称碱草，广泛分布于36°～62° N、92°～132° E，是一种生态幅度宽广的旱中型植物[1]，具有抗逆性强、粗蛋白含量高、产量高等优良特性，在改善我国北方草原生态环境、发展草原畜牧业方面发挥着重要作用[2]。通常情况下，生长在天然草原的羊草经常面临极端气温、土壤养分贫瘠和盐碱胁迫的挑战。目前，已有学者从生理学层面对羊草如何响应逆境胁迫进行了研究。通常情况下，逆境胁迫时羊草的发芽率下降，株高、叶面积、地上生物量等生长指标受到显著抑制[3]；叶片气孔阻力增大，光合效率与蒸腾速率减弱[4]；无机离子含量发生明显变化[5]，多种酶活性受到抑制[6]。通过提高空气中CO2浓度[7]，施用适当浓度的油菜素内酯、5-氨基乙酰丙酸等植物生长调节剂或氮、磷、钾等叶面营养[8-10]有助于羊草体内脯氨酸(Proline，Pro)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、有机酸的合成[11-12]以及超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)、过氧化物酶(Peroxidase，POD)活性的增强[13-14]，能够有效缓解逆境胁迫对羊草生长带来的危害。另一方面，随着测序技术的快速发展，羊草的基因组学研究也逐渐开展，学者们开始深入到分子生物学层面探讨羊草的抗逆性机制，尤其是在优良抗逆性基因的挖掘方面已取得重要成果。目前已在羊草体内鉴定到的抗逆基因很多，如抗盐胁迫基因LcLHP[15]，抗盐碱的铁蛋白基因FER[16]、Na+/H+逆向转运蛋白基因NHX1[17]，抗低温的叶绿体基因FIN2[18]以及抗旱基因WRKY5[19]等。

钙是植物生长发育必需的矿质元素，一方面Ca2+参与维持细胞壁、细胞膜结构的稳定[20]；另一方面Ca2+作为细胞内的第二信使，参与多种生理生化过程及酶活性的调节[21-22]。近年来，钙对植物抗逆性的影响研究备受关注。加入外源钙能在一定程度上缓解胁迫对植物的伤害[23]，这一方法已广泛应用于小麦[24]、燕麦[25]、苜蓿[26]等植物的抗逆性研究中，但是关于钙是否能帮助提高羊草抗逆性的生理研究还较为匮乏，因此，基于无菌培养皿体系，通过模拟盐、碱、渗透、低温胁迫并向培养基中加入不同浓度的CaCl2溶液，对CaCl2在羊草应对4种非生物胁迫时的调节作用进行了分析，可为提高羊草耐受性提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

羊草种子于2018年9月采自内蒙古呼和浩特市和林格尔县，地理坐标为40°31′32.47″N，111°50′33.22″E。现保存于牧草与特色作物生物学教育部重点实验室。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基的配制 全营养培养基(CK)的配制：以1 L为例，0.5 mol/L MES 10 mL，100×MS Fe盐5 mL，1 mol/L H3PO41 mL，1 mol/L CaCl21 mL，1 mol/L MgSO41 mL，100×MS MnSO45 mL，200×MS微量元素2.5 mL，1 mol/L KNO35 mL，BTP调节溶液pH值至5.7，加入1%蔗糖与1.1%琼脂。121 ℃高温高压灭菌20 min，倒入10 cm×10 cm的方形塑料培养皿中，凝固后备用。

1.2.2 试验处理 在CK的基础上，通过改变培养基中的NaCl浓度模拟盐胁迫，改变pH值模拟碱胁迫，改变Mannitol浓度模拟渗透胁迫，改变羊草幼苗的生长温度模拟低温胁迫。每种试验处理设置5个生物学重复。具体试验处理如下：含不同浓度CaCl2(0，1，20 mmol/L)并含不同浓度NaCl(0，150 mmol/L)；含不同浓度CaCl2(0，1，20 mmol/L)并含不同pH值(5.7，8.5)；含不同浓度CaCl2(0，1，20 mmol/L)并含不同浓度Mannitol(0，300 mmol/L)；含不同浓度CaCl2(0，1，20 mmol/L)并含不同生长温度(23，4 ℃)。

1.2.3 钙对盐、碱、渗透胁迫下羊草幼苗生长特性的影响 将羊草种子浸泡于去离子水中，置于4 ℃冰箱内，5 d后挑取已沉底种子，用含有5% NaClO+0.1% Triton X-100的溶液消毒30 min，之后用去离子水清洗6次，备用。消毒后的羊草种子播种在不同试验处理的培养基中，置于生长室内黑暗春化2 d后进行竖直培养。光照11 d后，观察表型并拍照，测量根长、叶长、鲜质量数据。生长室的培养条件为：(22±2)℃，光周期为12 h光照/12 h黑暗，光照强度150 μmol/(m2·s)。

1.2.4 钙对低温胁迫下羊草幼苗生长与生理特性的影响 利用RDN-400D-3型人工气候箱对供试羊草进行培养，通过改变气候箱中的昼/夜温度模拟低温胁迫。将消毒后的羊草种子分别播种在3种不同浓度CaCl2的培养基上，置于人工气候箱内(对照组：昼/夜为23 ℃/23 ℃)黑暗春化2 d后，分别放入23 ℃/23 ℃、23 ℃/4 ℃环境中进行竖直培养。光照11 d后，观察表型，采集根长、叶长、鲜质量数据，并拍照。同时利用苏州科铭生物技术有限公司生产的试剂盒(http：//www.cominbio.com/)对羊草叶中的丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、还原型谷胱甘肽(Reduced glutathione，GSH)、还原型抗坏血酸(Ascorbic acid，AsA)含量及超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、过氧化物酶(Peroxidase，POD)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidase，APX)、谷胱甘肽还原酶(Glutathione reductase，GR)酶活性进行测定。

1.3 统计分析

应用Excel 2010软件进行数据整理，SPSS 16.0软件进行统计分析，用Dunnett法比较不同处理间的差异。

2 结果与分析

2.1 钙对盐胁迫下羊草种子发芽率和幼苗生长特性的影响

2.1.1 钙对盐胁迫下羊草种子发芽率的影响 由图1可知，与0 mmol/L NaCl相比，相同CaCl2浓度下150 mmol/L NaCl胁迫会显著抑制羊草种子萌发(P<0.05)。0 mmol/L NaCl条件下，3种不同浓度CaCl2的培养基上，羊草种子的发芽率为96.23%～99.04%，不同处理间的差异不显著(P>0.05)。150 mmol/L NaCl胁迫时，当补加CaCl2浓度由0 mmol/L增加至1～20 mmol/L时，羊草种子的发芽率由28.57%提高至85.00%，当补加1 mmol/L CaCl2后羊草种子发芽率显著提高。

2.1.2 钙对盐胁迫下羊草幼苗生长特性的影响 由图2可知，与0 mmol/L NaCl相比，相同CaCl2浓度下150 mmol/L NaCl胁迫时羊草幼苗的根长、叶长和鲜质量都显著降低(P<0.05)，其中根长降低18.87%～25.49%，叶长降低47.18%～51.18%，鲜质量降低50.32%～74.47%。由此可见，150 mmol/L NaCl胁迫时羊草幼苗的生长受到抑制。0 mmol/L NaCl条件下，3种不同浓度CaCl2的培养基上，羊草幼苗的根长、叶长和鲜质量均无显著差异(P>0.05)。150 mmol/L NaCl胁迫时，当外源CaCl2浓度为0 mmol/L时，羊草幼苗的生长受到显著抑制，羊草幼苗的根长、叶长数据无法准确采集，只采集到其鲜质量数据；当外源CaCl2浓度增加至1 mmol/L时，羊草幼苗的根长、叶长和鲜质量显著增加(P<0.05)，其中鲜质量增加了90.36%。当外源CaCl2浓度由1 mmol/L增加至20 mmol/L时，羊草幼苗的根长、叶长和鲜质量均无显著性差异(P>0.05)。综上所述，补加1 mmol/L外源CaCl2能有效缓解150 mmol/L NaCl胁迫对羊草幼苗生长的抑制作用。

为了与一般纳税人增值税纳税申报表相衔接，以“应纳税额”专栏替代原来的“转出未交增值税”、“转出多交增值税”专栏，用以结转计算一般计税当月应纳增值税。

2.2 钙对碱胁迫下羊草幼苗生长特性的影响

由图3可知，与pH值5.7相比，相同CaCl2浓度下pH值8.5胁迫时羊草幼苗的根长、叶长、鲜质量基本都降低，其中根长降低10.71%～20.35%，叶长降低40.84%～47.84%，鲜质量降低43.15%～47.69%。结果表明，pH值8.5胁迫时羊草幼苗的生长受到抑制。pH值5.7条件下，3种不同浓度CaCl2的培养基上，羊草幼苗的根长、叶长和鲜质量均无显著性差异(P>0.05)。pH值8.5胁迫时，3种不同浓度CaCl2的培养基上，羊草幼苗的叶长和鲜质量均无显著性差异(P>0.05)。当培养基中CaCl2浓度由0 mmol/L增加至1 mmol/L时，羊草幼苗的根长增加14.94%；当CaCl2浓度由1 mmol/L增加至20 mmol/L时，羊草幼苗的根长下降10.00%。总的来说，补加外源CaCl2并未有效缓解pH值8.5胁迫对羊草幼苗生长的抑制作用。

2.3 钙对渗透胁迫下羊草幼苗生长特性的影响

由图4可知，与0 mmol/L Mannitol相比，相同CaCl2浓度下300 mmol/L Mannitol胁迫时羊草幼苗的根长、叶长和鲜质量均显著降低(P<0.05)，其中根长降低27.70%～35.20%，叶长降低47.14%～50.00%，鲜质量降低38.35%～41.74%。结果表明，300 mmol/L Mannitol胁迫时羊草幼苗的生长受到抑制。0 mmol/L Mannitol条件下，3种不同浓度CaCl2的培养基上，羊草幼苗的根长、叶长和鲜质量均无显著性差异(P>0.05)。300 mmol/L Mannitol胁迫时，3种不同浓度CaCl2的培养基上，羊草幼苗的根长、叶长和鲜质量均无显著性差异(P>0.05)。结果表明，补加外源CaCl2并未有效缓解300 mmol/L Mannitol胁迫对羊草幼苗生长的抑制作用。

2.4 钙对低温胁迫下羊草幼苗生长和生理特性的影响

2.4.1 钙对低温胁迫下羊草幼苗生长特性的影响 由图5可知，与对照(23 ℃)相比，相同CaCl2浓度下4 ℃胁迫时羊草幼苗的叶长、鲜质量显著降低(P<0.05)，其中叶长降低23.72%～49.12%，鲜质量降低26.91%～43.35%。当CaCl2浓度为0 mmol/L，4 ℃胁迫时羊草的根长会显著降低20.19%；当CaCl2浓度为1 mmol/L时，对照和低温胁迫下羊草的根长差异不显著(P>0.05)；当CaCl2浓度为20 mmol/L，4 ℃胁迫时羊草的根长会显著降低20.85%。总的来说，4 ℃低温胁迫时羊草幼苗的生长受到抑制。23 ℃生长条件下，3种不同浓度CaCl2的培养基上，羊草幼苗的根长、叶长和鲜质量均无显著性差异(P>0.05)。4 ℃胁迫时，当外源CaCl2浓度由0 mmol/L增加至1 mmol/L时，羊草幼苗的根长、叶长与鲜质量均显著增加(P<0.05)，其中根长增加19.88%，叶长增加18.10%，鲜质量增加23.25%。当CaCl2浓度由1 mmol/L增加至20 mmol/L时，羊草幼苗的根长会下降16.08%，而叶长与鲜质量分别增加了19.71%，11.90%。综上所述，补加20 mmol/L外源CaCl2能有效缓解4 ℃低温胁迫对羊草幼苗生长的抑制作用。

2.4.2 钙对低温胁迫下羊草的膜脂过氧化物和保护酶活性的影响 MDA是植物在遭遇逆境胁迫时膜脂过氧化物作用的产物，其含量大小间接反映了细胞膜受损程度。由图6可知，与对照(23 ℃)相比，相同CaCl2浓度下4 ℃胁迫时羊草叶中MDA含量(以鲜质量计)显著升高(P<0.05)。4 ℃胁迫时，补加外源CaCl2后羊草叶中MDA含量会显著下降(P<0.05)。当补加CaCl2浓度分别为1，20 mmol/L时，MDA含量分别降低了27.41%，36.78%，这表明补加外源CaCl2能降低羊草叶中MDA的积累量，有效缓解低温胁迫对膜的损害。

与对照(23 ℃)相比，当CaCl2浓度在0～1 mmol/L时，4 ℃胁迫对羊草叶中SOD活性(以鲜质量计)影响不显著(P>0.05)；当CaCl2浓度为20 mmol/L时，SOD活性显著增加11.68%。4 ℃胁迫时，当外源CaCl2浓度由0 mmol/L增加至1～20 mmol/L时，羊草叶中SOD活性提高至原来的1.73～2.03倍。当CaCl2浓度为20 mmol/L时，羊草叶中SOD活性最高。

与对照(23 ℃)相比，相同CaCl2浓度下4 ℃胁迫时羊草叶中POD活性(以鲜质量计)显著增强了15.89%～50.58%。4 ℃胁迫时，补加1 mmol/L CaCl2时对羊草叶中POD活性无显著影响，补加20 mmol/L CaCl2时POD活性显著增加7.41%～12.60%。

与对照(23 ℃)相比，相同CaCl2浓度下4 ℃胁迫时羊草叶中CAT活性(以鲜质量计)显著提高至原来的1.02～1.14倍。4 ℃胁迫时，补加1 mmol/L CaCl2时对羊草叶中CAT活性无显著影响，补加20 mmol/L CaCl2时CAT活性显著增加12.87%～17.01%。

与对照(23 ℃)相比，相同CaCl2浓度下4 ℃胁迫时羊草叶中GR活性未发生显著变化(P>0.05)。4 ℃胁迫时，补加1 mmol/L CaCl2对羊草叶中GR活性无显著影响，补加20 mmol/L CaCl2时GR活性显著增加14.52%～27.95%。

与对照(23 ℃)相比，相同CaCl2浓度下4 ℃胁迫时羊草叶中GSH含量(以鲜质量计)未发生显著变化(P>0.05)。4 ℃胁迫时，3种不同浓度CaCl2的培养基上，羊草叶中GSH含量均无显著性差异(P>0.05)。

与对照(23 ℃)相比，相同CaCl2浓度下4 ℃胁迫时羊草叶中还原型AsA含量(以鲜质量计)显著增加了20.50%～38.94%。4 ℃胁迫时，补加1 mmol/L CaCl2对羊草叶中还原型AsA含量无显著影响，补加20 mmol/L CaCl2时还原型AsA含量显著增加13.90%～20.31%。

总的来说，低温胁迫下，补加20 mmol/L CaCl2时羊草叶中MDA含量降低，SOD、POD、CAT、GR活性增强，还原型AsA含量增加，羊草的抗寒能力明显提高。

3 讨论与结论

3.1 钙调节羊草非生物胁迫耐受性的作用

本研究发现，150 mmol/L NaCl胁迫时羊草种子发芽率、根长、叶长和鲜质量均显著下降，羊草生长受到抑制。这是因为高浓度的NaCl能置换细胞膜上的Ca2+，使得膜结合的Na+/Ca2+增加，导致膜结构受到损伤，通透性增加，引起细胞内溶质外渗[27]；此外，NaCl胁迫下植物的净光合速率和蒸腾速率呈下降趋势[28]，将会影响光合作用、矿质元素吸收等生理活动过程，致使植物生长受阻，生物量减少[29-30]。当补加外源CaCl2后羊草种子的发芽率提高，根长、叶长、鲜质量增加，表明CaCl2能有效缓解盐胁迫对羊草幼苗生长的抑制作用，这与Genc等[31]、杨利艳等[32]在研究Ca2+对小麦萌发及抗盐性效应时得出的结果一致，即一定浓度的CaCl2能促进种子萌发、缓解盐害对幼苗生长的抑制作用。引起该结果的原因可能是由于补加外源Ca2+后细胞膜脂组分中的磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PG)、磷脂酰甘油(PA)含量增加，高水平的磷脂可结合更多的Ca，增大质膜磷脂单层的稳定性，改变蛋白质结构，使得Na+、氯化物不易进入细胞[33]，在一定程度上降低质膜的透性及膜脂过氧化程度；另外，外源Ca2+的加入能弥补植物自身因Ca2+不足引起的营养胁迫，维持植物体内矿质元素(K、Ca)的正常代谢吸收[34]。然而当补加CaCl2浓度在1～20 mmol/L时，羊草种子发芽率、根长、叶长、鲜质量没有发生显著变化，说明并非外源Ca2+浓度越高羊草幼苗的抗盐性越强，这与韩志平等[35]、李春燕等[36]的研究得出的结论相似。盐胁迫条件下补加外源CaCl2时，Ca2+本身会产生盐胁迫[36]，而Cl-大量累积也会加重盐胁迫，此时植物细胞内的脂质含量下降，对细胞膜结构完整性造成损伤[37]，最终导致植物的生长受抑制。

pH值8.5胁迫或300 mmol/L Mannitol胁迫时，羊草幼苗的根长、叶长和鲜质量等生长指标均受到显著影响，但是补加1～20 mmol/L CaCl2后并未有效缓解碱胁迫或渗透胁迫对羊草幼苗生长的抑制作用，这与Chen等[38]、宋新妍等[39]、姜义宝等[40]的类似研究结果存在差异。Chen等[38]在研究盐碱胁迫与外源Ca2+交互作用对多花黑麦草生长和渗透调节的影响时发现，当外源Ca2+浓度为6 mmol/L时，黑麦草叶片中脯氨酸含量最低，叶绿素含量、根系活力和Mg2+含量最高，植株生长受抑状况得到显著改善。宋新妍等[39]在研究钙处理对小麦抗旱性的影响时发现，100 mmol/L CaCl2喷施处理小麦苗期叶片能使Pro、可溶性糖含量增加，MDA含量降低，SOD活性升高。姜义宝等[40]在研究钙处理对苜蓿幼苗抗旱性的影响时发现，20 mmol/L CaCl2处理能有效提高苜蓿的抗旱性。本研究与以往类似研究结论不一致的原因可能与外源CaCl2浓度、植物种类、胁迫程度等多个因素密切相关。

4 ℃低温胁迫时，羊草幼苗的生长受到了抑制，根长、叶长和鲜质量显著下降，这与张燕[41]在研究不同温度对羊草形态特征的影响时得出的结论一致，即低温处理会显著降低羊草的株高、干鲜质量、根系活力。补加CaCl2后羊草幼苗在低温胁迫下的受抑制作用得到显著缓解，为了深入分析钙的调节作用，对加入CaCl2前后羊草幼苗体内的生理指标进行了测定。结果发现，低温胁迫时羊草叶中MDA含量、POD、CAT活性显著增加，这表明低温胁迫时羊草体内的活性氧过多积累导致膜脂过氧化，此时抗氧化系统开始发挥作用。当补加外源CaCl2后羊草叶中MDA含量降低，SOD、POD、CAT、GR活性及还原型AsA含量增加，这与胡丽涛[24]、张丽等[42]、Shi等[43]在研究外源CaCl2在小麦、裸燕麦、百慕达草应对冷胁迫时所起的调节作用结果一致。Ca2+是植物体内的一种信号分子，当低温胁迫发生时，位于质膜及内质网膜上的Ca2+通道打开，此时细胞质Ca2+浓度将发生变化，产生钙信号。Ca2+与受体蛋白CaM结合形成多功能的调节蛋白Ca2+-CaM，调控Ca2+-ATPase等下游靶蛋白酶的活性，继而引发相应的生理响应以抵御逆境胁迫[24]。

3.2 研究不足之处

生长在自然条件下的羊草常受到极端气温、土壤养分贫瘠和盐碱胁迫的影响，不仅严重损害了它的产量与品质，甚至会阻碍畜牧业的持续发展。因此，本研究在模拟盐、碱、渗透和低温4种非生物胁迫的基础上，重点探讨了添加外源CaCl2是否有助于提高羊草幼苗的耐受性。然而研究中仍存在些许不足之处：非生物胁迫下，羊草幼苗的生长受到了抑制，但是仅选取了低温这一因素深入分析了加入CaCl2前后羊草幼苗体内多种防御酶的变化。这是因为①150 mmol/L NaCl胁迫下，当外源CaCl2为0 mmol/L时羊草种子的发芽率极低，幼苗的生长发育受到显著抑制，收集到的羊草幼苗无法满足生理试验测定，因此并未对不同组合处理间羊草体内的防御酶进行测定。陈全战等[44]在研究钙对盐胁迫下向日葵幼苗光合生理特性的影响时发现，150 mmol/L NaCl胁迫条件下，经过钙处理后的植物幼苗其体内的SOD、POD和CAT活性明显提高，MDA含量降低，这为本研究“150 mmol/L NaCl胁迫时加入CaCl2前后羊草幼苗体内防御酶的变化”提供了可参考的数据。②pH值 8.5或300 mmol/L Mannitol胁迫下，补加外源CaCl2没有显著提高羊草幼苗的抗碱性或抗旱性，因此未再进一步分析碱、干旱胁迫时羊草幼苗羊草体内防御酶等的变化。今后可在已有的基础上，通过增设CaCl2浓度梯度，改变盐、碱和渗透胁迫程度更细致探讨钙在羊草应对胁迫时的调节作用，为提高羊草适应性及其栽培生产和开发利用提供理论依据。

3.3 结论

补加外源 CaCl2可以提高羊草的抗盐能力和抗低温能力，但是对羊草的抗碱和抗渗透胁迫能力没有改善，这表明钙在羊草应对非生物胁迫时的调节作用受到CaCl2浓度、胁迫类型与程度的共同影响。