基于网络药理学与分子对接探讨鸡血藤-桑寄生治疗糖尿病周围神经病变的分子机制

侯亚威 李亚蒙 徐玉坤 肖振卫

1.山东中医药大学中医学院，山东济南 250000；2.山东中医药大学附属医院老年医学科，山东济南 250000；3.山东中医药大学附属医院肾病科，山东济南 250000

糖尿病周围神经病变（diabeticperipheralneuropathy，DPN）是糖尿病最常见的并发症之一，主要以手脚或腿疼痛、感觉异常为特征，并伴有周围神经病变[1]。炎症介质、代谢异常及神经元活性与DPN 的发病机制密切相关，DPN 的治疗可能涉及到多种联合治疗，其中包括控制血糖水平和疼痛，研究者们一直寻求治疗DPN 最有效的手段[2]。

DPN 在中医属消渴病中“痹症”范畴，认为此病病机多为“气虚血瘀”，同时，多年临床实践发现鸡血藤-寄生在改善DPN 患者的疼痛状态及感觉异常方面效果显著，查阅资料发现，桑寄生-鸡血藤亦是祝谌予老师之经验伍用，其与降糖药参合，屡见奇效[3]。鸡血藤，味苦微甘，性温，归肝经，能够补血活血、舒筋络；桑寄生，味苦甘，性平，可补肝肾，强筋骨；二者伍用，补肝肾、强筋骨、通络之力加强[4-5]。

中药方剂治疗疾病在网络药理学中具有多成分、多靶点、多通路的特点，现运用网络药理学技术探索鸡血藤-桑寄生治疗DPN 的分子机制，并通过分子对接进行验证。

1 材料与方法

1.1 药物相关靶点的筛选

通过中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP）寻找2 味中药化学组成成分，并进行ADME 筛选，按照口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（drug likeness，DL）≥0.18 两个阈值初步获得药物的有效活性成分及靶点，并通过TCMID 及中国知网、万方搜集2017 年2 月至2020 年12 月的文献补充未预测到的靶点，删除未预测到的靶点成分，并在Uniprot 数据库规范化合物作用的靶点[6-8]。

1.2 “药物-活性成分-靶点”网络图构建

将药物活性成分及靶点导入Cytoscape 3.7.2 中，构建“药物-活性成分-靶点”网络图，并获取药物主要成分。

1.3 疾病相关靶点的筛选

在GeneCards 中挖掘DPN 的潜在靶点，根据学者经验，设Score 值≥2 倍中位数的靶点为DPN 的潜在靶点[9]，并在TTD、DRUGBANK 中寻找DPN 靶点，删除重复靶点。

1.4 药物疾病交集靶点获取及蛋白质-蛋白质相互作用分析（proteinprotein interaction，PPI）网络构建

为明确药物-疾病靶点间的相互作用，利用R 语言绘制维恩图，获取交集靶点，通过STRING 数据库进行PPI 分析，获得PPI 网络，借助Cytoscape 3.7.2，对PPI 网络进行拓扑分析及可视化，并获取核心靶点[10]。

1.5 GO 与KEGG 分析及其可视化

将核心靶点导入Metascape 平台，完成GO 及KEGG 分析，通过生物信息平台对结果进行可视化分析[11]。

1.6 “药物-成分-通路-靶点”网络图构建

通过Cytoscape 3.7.2 构建“药物-成分-通路-靶点”网络图，根据度值获取鸡血藤-桑寄生治疗DPN发挥作用的核心成分及通路。

1.7 分子对接验证

为进一步验证“1.6”中核心成分及其靶点在能量和结构上匹配程度，依据TCMSP 获取化合物小分子2D 结构，采用ChemDraw、Chem3D 获得化合物小分子的3D 结构，运用Pymol，对其进行去水、移除靶蛋白中的配体。从RCSBPDB 中获取靶蛋白的3D 结构。采用AutoDockTools，设置其活性口袋，运行Autodockvina 进行分子对接，并采用PyMol 进行结构匹配及可视化分析[12]。

2 结果

2.1 药物靶点的获取

初步获得化学成分：鸡血藤68 种、桑寄生46 种，经ADME 筛选后共获得活性成分：鸡血藤23 种、桑寄生2 种，见表1。鸡血藤靶点426 个、桑寄生靶点157 个，删除重复靶点共得到178 个靶点。

表1 药物主要成分

2.2 “药物-活性成分-靶点”网络图构建

“药物-活性成分-靶点”网络图，共得到203 个节点，456 条边，椭圆形代表靶点，菱形代表活性成分，三角形代表药物。见图1。

图1 “药物-活性成分-靶点”网络图

2.3 疾病靶点的获取

在GeneCards 数据库获得疾病靶点4778 个。该靶点Score 中位数为5.54，故设定Score 值≥11.8 的靶点为DPN 的潜在靶点。结合TTD、OMIM、DRUGBANK补充靶点，删除重复值，得到1199 个靶点。

2.4 维恩图及PPI 网络构建

药物靶点及DPN 靶点筛选后取交集，绘制纬恩图，得到78 个交集靶点，见图2。PPI 网络共有1413 条边，见图3。对PPI 网络进行拓扑分析，得到64 个核心靶点，见图4。

图2 “药物-疾病”维恩图

图3 蛋白质-蛋白质相互作用网络分析

图4 蛋白质-蛋白质相互作用拓扑分析

2.5 GO 与KEGG 分析

通过Metascape 平台对“2.4”中核心靶点进行通路信号分析，以富集分析的中位数为依据，GO 中生物过程（biological process，BP）选取25 个、GO 的细胞成分（cell componcnt，CC）选取10 个、GO 的分子功能（molecular furction，MF）选取9 个进行富集三合分析，见图5。KEGG 选取22 条通路进行可视化，见图6（封四）。

图5 核心靶点GO 分析

图6 KEGG信号通路气泡图

2.6 “药物-成分-通路-靶点”网络图构建

借助Cytoscape 3.7.2 绘制“药物-成分-通路-靶点”网络图，对“2.5”中KEGG通路进一步分析，该网络有66 个节点，118 条边，方形代表靶点，菱形代表成分，椭圆形代表通路，三角形代表药物，并根据度值发现TP53、EGFR、ESR1（度值分别为12、10、4）为主要核心靶点及其成分、通路。见图7。

图7 “药物-成分-通路-靶点”网络图

2.7 分子对接结果

“2.6”中主要核心靶点与其成分对接结果所示，槲皮素、木犀草素、芒柄花黄素、毛蕊异黄酮与相应靶点都具有较好的亲和力，具体见表2，对接模式见图8。

图8 分子对接模式图

表2 分子对接结合能

3 讨论

鸡血藤作为常用的活血通络药，亦为“血分圣药”，具有抗炎、抗氧化等功效；桑寄生具有神经保护、降血糖等作用；DPN 的发生发展是氧化应激、糖脂类代谢异常、JAK-STAT 信号通路维持机体内环境的稳定失调及雪旺细胞的病变等综合作用的结果[13-17]。

鸡血藤、桑寄生主要活性成分为槲皮素、木犀草素、芒柄花黄素；王保江等[18]进行大鼠实验发现槲皮素能够改善四氧嘧啶所致的DPN；施建丰等[19]发现木犀草素可能通过改变巨噬细胞的极性从而调节炎症介质的表达；木犀草素能够在各种神经退行性变中降低氧化应激[20]。

PPI 网络拓扑分析阐释蛋白互作关系，并筛选出64 个核心靶点，结合GO 分析，其中EGFR 属于酪氨酸激酶受体，EGFR 二聚自磷酸化后主要引导下游MAPK、JAK-STAT 及PI3K-Akt通路磷酸化，调控脂多糖引起的炎症、细胞凋亡及氧化应激反应；PARP1 上调则细胞存活，抑制PARP1 则诱导细胞凋亡；ESR1调控内分泌系统、甲状腺激素的分泌；TP53通过磷酸化调节其活性，通过调控下游MAPK、PI3K-Akt、Wnt 等通路参与调控细胞周期、调节上游代谢基因表达、促进DNA 修复基因转录等生物学过程[21-23]。

KEGG中选取MAPK、JAK-STAT、PI3K-Akt 等22 条信号通路分析，发现木犀草素与槲皮素通过MAPK信号通路调控氧化应激反应、炎症反应;木犀草素、槲皮素干预的PI3K-Akt 信号通路参与葡萄糖的转运、增殖、凋亡和分化等多种细胞功能；芒柄花黄素、毛蕊异黄酮通过内分泌抵抗、甲状腺激素信号通路调控糖脂代谢，促进新血管生成的生物过程[24-26]。分析对接验证中发现，活性成分与对应靶点均<-5 kcal/mol，研究者认为结合能<-5 kcal/mol 是分子对接时受体与配体稳定结合的标准，且结合能越低分子对接结合稳定性越高[27]；故活性成分与对应的靶点有较好的对接活性。

本研究探讨鸡血藤-桑寄生治疗DPN 的分子机制，发现鸡血藤-桑寄生主要通过EGFR、ESR1、PARP1等64 个与DPN 相关的潜在靶点，改善糖脂类代谢、保护神经元、调控细胞凋亡，且分子对接验证了这一结果的可靠性，为临床治疗及研发新的药物提供思路。