犬急性冠脉闭塞后血小板白细胞聚集体变化特点实验研究

马 婷，马靖雯，关丽娜，穆玉明

（新疆医科大学第一附属医院心脏超声科，乌鲁木齐 830054）

急性冠脉闭塞形成的主要原因是血栓栓塞冠状动脉导致心肌缺血的改变,此时心肌HE 染色未出现心肌灶状坏死，重者会进一步发展成为急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)。心肌肌钙蛋白T(Cardiac Troponin,cTnT)是一种高灵敏、高特异性反映心肌细胞损伤及坏死的血清标志物，cTnT 在AMI发生4～6 h 内增高，24 h 达峰值，可持续5 d，但胸痛6 h内诊断灵敏度较低。因此在急性冠脉闭塞期探究新的生物指标，联合cTnT检测，对于更早发现急性心肌梗死显的尤为重要。

血小板(Platelet,PLT)是一种小的无核细胞，活化后与不同类型的白细胞通过P-选择素糖蛋白配体1与粘附分子P-选择素相结合，白细胞与PLT 粘附在血管损伤部位形成血小板-白细胞结合物（Platelet Leukocyte Aggregation，PLA），这也是白细胞促进血栓形成和PLT促进炎症的重要机制[1-2]。

本研究从炎症角度出发，应用介入术制备犬急性冠脉闭塞模型，探讨犬处于急性冠脉闭塞时PLA的变化特点及应用价值，分析炎症反应变化与病理表现是否同步，并与cTnT 进行比较，以期更快、更早发现急性冠脉闭塞。

1 材料与方法

1.1 实验动物选取10～13 个月龄的健康比格犬15只（均由新疆医科大学动物实验中心提供），体重10～15 kg，雌雄不限，术前禁食12 h、禁水6 h，所有比格犬的处置均根据新疆医科大学伦理委员会的相关规定(动物伦理委员会审批号：IACUC-20170608-01)。

1.2 应用犬静脉血体外模拟制备混合性血栓抽取比格犬静脉血，放入枸橼酸钠抗凝管中，抽取上层富含PLT的血浆层及中间边界层，混合注入EP管中，再依次加入腺苷二磷酸、凝血酶、二氯化钙（CaCl2），形成的血凝块孵育在恒温箱，经病理证实为混合性血栓[3]。

1.3 经皮冠状动脉介入术置入混合性血栓制备犬急性冠脉闭塞模型将犬麻醉后，气管插管，呼吸机及电除颤仪备用，局部备皮。 实时动态监测心电图、血压以及股动脉压力变化情况；经皮穿刺犬右侧股动脉，将体外制备的混合性血栓置入冠状动脉内，行冠脉造影确认血流是否被阻断。 冠脉造影显示：左前降支中远段部位冠脉完全闭塞，血流被阻断，TIMI(the Thromboly⁃sis in Myocardial Infarction)分级为0 级。

1.4 血样的采集及测定于术前、闭塞时及闭塞后30 min、1 h、2 h 抽取犬静脉血，于闭塞后2 h、4 h 抽取犬动脉血备用。

1.4.1 cTnT 的测定 将闭塞后2 h、4 h 抽取的犬动脉血（5 mL），注入有肝素涂层的真空试管中，4℃下以4 000 r/min 离心10 min，取上清液，低温-80℃保存备用。依照犬心肌特异性肌钙蛋白T（cTnT）酶联免疫试剂盒使用方法，测定犬血清中cTnT含量。

1.4.2 PLT 活化标志物CD62P 检测 取100 µL 血样加入流式管中，设置空白对照管，IgG1-FITC、IgG1-PE 同型对照管，CD61-FITC、CD62P-PE 单标管各一个，以及样品管。空白对照管中不加抗体，同型对照管同时加入20 µL IgG1-FITC、IgG1-PE，在单标中分别加入20 µL CD61-FITC、20 µL CD62P-PE 抗体，在样品管中同时加入20 µL CD61-FITC、20 µL CD62PPE 抗体，室温避光孵育15 min；加入2 mL 红细胞Ly⁃sis Buffer（1×）溶血素，室温避光放置10 min，300 g 离心5 min，弃上清；用2 mL PBS 洗涤2 遍，300 g 离心5 min，去上清，加入500 µL PBS 重悬沉淀，上机检测。设门：通过调节电压将空白细胞群置于阴性区中；再通过单标样品调节补偿，使样品分群明显后，进行待检测样品的鉴定。以CD61-FITC 标记PLT，CD62PPE/CD61-FITC双阳性活化PLT。

1.4.3 PLA、PMA、PNA、PlyA 检测方法 弃去前2 mL血液，获取枸橼酸钠抗凝全血标本。取血样入管，设置空白对照管，IgG1-FITC 同型对照管、CD45-Per⁃CP-CyTM5.5、CD14-APC、CD61-FITC 单标管各1 个。空白对照管中不加抗体，同型对照管加入20 µL IgG1-FITC，在单标中分别加入5 µL CD45-PerCPCyTM5.5，20 µL CD14-APC，20 µL CD61-FITC 抗体，在样品管中同时加入5 µL CD45-PerCP-CyTM5.5，20 µL CD14-APC，20 µL CD61-FITC 抗体，孵育；加入溶血素，避光放置，加入PBS 重悬沉淀，上机检测。设门同前。通过CD45-PerCP-CyTM5.5 标记所有白细胞，以CD61-FITC 标记PLT，APC-CD14 标记单核细胞。在CD45-PerCP-Cy/SSC 散点图中，将白细胞分为中性粒细胞、淋巴细胞，CD14-APC/SSC 区分单核细胞；通过各自细胞群CD61 阳性率分别检测PLA占总白细胞百分率、PMA 占总单核细胞百分率、PNA占总粒细胞和PLyA 占总淋巴细胞百分率，分别以PLA（%）、PMA（%）、PNA（%）和PLyA（%）表示。

1.5 组织病理染色术后处死实验犬取其心脏后，用生理盐水或Krebs-Henseleit缓冲液灌注，清洗后观察其外形的变化，从冠脉闭塞区域垂直于长轴将心脏切成厚约10 mm 的心肌片，10%的甲醛固定、石蜡包埋及组织切片后用HE染色。

1.6 统计学分析采用SPSS 19.0 统计软件进行分析,多组间比较应用单因素方差分析,方差齐时采用LSD法进行组间多重比较,方差不齐时采用Dunnett'sT3 法进行组间多重比较，实验数据以均数±标准差（±s）表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 混合性血栓的制备与犬急性冠脉闭塞模型的建立前期研究病理结果示此为混合性血栓[3]。冠脉造影显示：左前降支中远段部位冠脉完全闭塞，血流被阻断，TIMI 分级为0 级。将血栓置入冠状动脉后，心电图可见胸前导联显著增高，呈ST段弓背形抬高。

2.2 CD62P 阳性率检测结果流式细胞图谱（图1）分析示在CD62P 阳性率的检测中，闭塞时、闭塞后30 min、1 h、2 h较术前均降低，差异具有统计学意义（P<0.05），闭塞后2 h 降低最明显，差异具有统计学意义（P<0.05）（见表1）。

图1 活化PLT检测的流式图

表1 CD62P阳性率检测（n=15）

2.3 PLA、PMA、PNA、PlyA 的表达流式细胞图谱（图2）分析量示，闭塞时、闭塞后30 min、1 h、2 h 的PLA 较术前均增高，差异具有统计学意义（P<0.05）；闭塞时、闭塞后30 min、1 h 的PMA 较术前未见明显增高，差异无统计学意义（P<0.05），闭塞后2 h较术前增高且差异具有统计学意义（P<0.05）；闭塞后30 min、1 h、2 h 的PNA 较术前均增高，差异具有统计学意义（P<0.05）；闭塞后2 h增高最明显，差异具有统计学意义（P<0.05）；闭塞时的PlyA 较术前增高，差异具有统计学意义（P<0.05）（表2、图3）。

图3 不同时段PLA、PMA、PNA、PLyA变化趋势图

表2 不同时段PLA、PMA、PNA、PLyA检测（n=60）

图2 PLA检测的流式图

2.4 犬急性冠脉闭塞不同时段血cTnT 的变化比较术前测定犬cTnT 为（0.1±0.1）µg/L，闭塞后2 h 测定犬cTnT 为（0.2±0.4）µg/L，闭塞后4 h 测定犬cTnT为（1.0±0.1）µg/L。

2.5 心肌HE 染色病理结果心肌纤维排列整齐，未见较粗大凝固性收缩带、心肌灶状坏死及炎细胞浸润等（图4）。

图4 心肌组织学改变病理图（×100）

3 讨论

本实验通过犬静脉血体外制备混合性血栓，将制备的混合性血栓经介入术置入冠状动脉内，成功制备了犬急性冠脉闭塞模型。

PLT 在维护血管壁的完整性、生理性止血以及某些病理过程如血栓形成、动脉粥样硬化和炎症反应等过程中起着重要作用，尤其是在急性冠脉综合征的发生发展中。在AMI 发生发展中，血小板的活化起到至关重要的作用，在正常的生理条件下，PLT 以不活跃的形式存在；当在体内外各种因素刺激下PLT发生变形、粘附、聚集和释放反应，当血栓阻塞冠脉，形成急性冠脉闭塞时，大量白细胞和PLT在急性缺血心肌中活化[4]，其中血小板α-颗粒膜糖蛋白(CD62P)就是一种血小板活化标志物，能够提高血小板的粘附能力，有促进血小板形成等功能[5]。本实验结果示CD62P 阳性率，犬急性冠脉闭塞时、闭塞后30 min、1 h、2 h 较术前均降低，且差异具有统计学意义，随着实验进行逐渐降低，于闭塞后2 h 降至最低，这与以往研究结果活化PLT可快速丢失其表面的CD62P[6]相符合。由于CD62P易快速降解且不够稳定，因此PLA较CD62P 相比能更稳定保留在外周血中[7]。PLA 又包括PNA、PMA 和PlyA。本实验CD62P 阳性率于闭塞后2 h 降至最低，PMA 水平于闭塞后2 h 开始明显增高，与其半衰期较长有关（约为30～60 min），且其为血小板活化的敏感标志物[8-9]。

有研究显示，与非急性冠状动脉综合征患者相比，急性冠状动脉综合征患者中PLA、PNA、PMA、PlyA 水平明显增高[10-12]。中性粒细胞主要通过分泌趋化因子聚集在缺血区的血管系统中，并分泌多种激素，如补体激活因子、白三烯等细胞因子，从而导致血管收缩及PNA 生成，这与本实验中犬急性冠脉闭塞时，闭塞后30 min、1 h、2 h 的PNA 较术前均增高相吻合。PNA 刺激中性粒细胞使其活化后，细胞内的染色质DNA 及抗菌颗粒蛋白等释放到细胞外形成网状结构，即中性粒细胞胞外诱捕网，最终参与了血栓形成。

cTnT 主要存在于肌原纤维细肌丝中，是肌动蛋白的主要成分，约5%左右存在于胞浆中[13]。在心肌细胞受到可逆性损伤时，胞浆中游离的cTnT 首先释放入血，导致血清cTnT 短暂性增高。如发生不可逆性损伤，导致心肌坏死，肌丝上结合池cTnT 释放[14]，导致血清cTnT 持续性增高。AMI 患者中cTnT 可显著增高，且持续较长时间。结扎犬冠状动脉左前降支，cTnT 在2 h 后显著升高，反映了心肌细胞的损伤程度，并且局部炎症连锁反应对心肌细胞损伤具有放大作用。本实验结果表明犬急性冠脉闭塞4 h 后cTnT 开始显著升高，说明2 h 犬处于急性冠脉闭塞状态，且心肌HE 染色病理切片示心肌及心肌纤维排列整齐，未见较粗大凝固性收缩带、心肌灶状坏死及炎细胞浸润。

本实验研究发现，犬处于急性冠脉闭塞时，HE染色心肌细胞未出现坏死，与术前比较，PLA 于闭塞时开始增高，cTnT 于闭塞后4 h 开始增高，说明犬处于急性冠脉闭塞时，炎症反应出现变化要早于心肌细胞的坏死性损伤。