基于网络药理学探讨四逆加人参汤治疗新冠肺炎的作用机制

赵欣华，张东旭，赵恬静，庞雪莹，刘松江

（1. 黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150000；2. 中国人民解放军总医院第八医学中心，北京 100091；3. 黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150000）

2020 年1 月世界卫生组织将新型冠状病毒病正式命名为Corona Virus Disease 2019（COVID-19）［1］。该病主要通过呼吸道飞沫和密切接触传播，传染度极高。主要临床表现为发热、干咳、乏力。重症患者多在发病1 周后出现呼吸困难和/或低氧血症，严重者可快速恶化为急性呼吸窘迫综合征、脓毒血症及多器官衰竭等。针对重症及危重型患者，目前多在对症治疗的基础上，采取积极防治并发症，预防继发感染，对多器官进行功能支持等手段［2］。在境外发病态势呈上升趋势的背景下，我国疫情得到有效控制，中医药发挥了重要作用［3］。

四逆加人参汤出自《伤寒论》，由人参、附子、干姜、炙甘草组成，具有回阳救逆、益气固脱的功效，被多个省级方案推荐应用于新冠肺炎重症期的治疗［4］。四逆加人参汤可能具有治疗COVID-19 的作用，但具体机制尚不清晰。本研究运用网络药理学平台，筛选对药物及疾病靶点，构建PPI 网络图以及生物过程分析及药物-成分-靶点-通路网络图，初步分析了四逆加人参汤治疗COVID-19 的作用机制，为基础研究和临床应用指明了方向。

1 材料与方法

1.1 四逆加人参汤成分筛选及作用靶点的获取

运用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP http：//tcmspw.com/tcmsp.php）检索四逆加人参汤中包含的药物人参、附子，、干姜、甘草，设置口服利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18，获取有效活性化合物，将此结果输入Uniprot 数据库，对靶点名称进行规范。

1.2 COVID-19 靶点的预测及Venn 图构建

运用GeneCards 和OMIM 数据库查询疾病靶点，将关键词“Novel coronavirus pneumonia”输入数据库，查询疾病靶点。将1.1 中药物靶点与疾病靶点输入R-3.6.3 软件进行映射，绘制Venn 图。

1.3 药物-靶点-疾病网络图的构建

为了更加清晰地展示药物、靶点与疾病之间的关系，运用Cytoscape 3.7.2 软件，构建药物-疾病-靶点网络图，结合靶点度值对该网络进行可视化分析。

1.4 PPI 相互关系网络构建

将四逆加人参汤治疗COVID-19 的潜在靶点输入相互作用平台String（http：//string-db.org/），进行相互作用蛋白查询，物种设置为“人”（“Homo sapiens”），最低相互作用评分设置为“Medium confidence（中等置信度）”0.400，其余参数保持默认设置，获取相互作用关系。将相互作用关系的TSV 数据格式输入到Cytoscape 3.7.2 软件，绘制PPI 网络，并使用插件network analyzer 对该网络进行分析，根据degree 值分析关键靶蛋白。

1.5 京都基因和基因组百科全书（KEGG）和基因本体（GO）生物过程富集分析

为了研究四逆加人参汤治疗COVID-19 的通路信息和生物过程、分子功能、细胞组分信息，运用DAVID（http：//david.nifcrf.gov/）数据库6.8 对交集靶点进行分析。设置P＜0.05，根据富集程度选取前20 条目，利用OmicShare 平台制作气泡图，对结果进行可视化分析。

1.6 成分-靶点-通路网络图构建

基于KEGG 信号通路结果并参考相关文献，筛选出与COVID-19 相关度较高的信号通路，运用Cytoscape 3.7.2 软件构建成分-靶点-通路网络图，并对网络图进行可视化分析。

2 结果

2.1 四逆加人参汤成分筛选及作用靶点的获取结果

基于TCMSP 共检索出四逆加人参汤中活性化合物附子65个，干姜148个，甘草280个，人参190个，设置筛选条件口服利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18 后，得到四逆加人参汤中有效活性化合物附子21 个，干姜5 个，甘草92 个，人参22 个，总有效活性化合物140 个，去除重复化合物及无对应靶点化合物，结合文献共筛选得到有效化合物112 个，对应234 个靶点。部分化合物及靶点信息见表1。

表1 四逆加人参汤活性成分及靶点信息表Tab 1 Active ingredients and targets of Sini Decoction plus Ginseng

2.2 COVID-19 靶点的预测Venn 图构建结果

运用GeneCards 和OMIM 数据库，得到疾病相关靶点261 个，将2.1 中药物靶点与疾病靶点输入R-3.6.3 软 件 进 行 映 射，绘 制Venn 图，得 到50 个 药物-疾病交集靶点。见图1。

图1 四逆加人参汤与COVID-19 靶点基因Venn 图Fig 1 Target gene Venn diagram of Sini Decoction plus Ginseng

2.3 药物-靶点-疾病网络图的构建结果

使用Cytoscape 3.7.2 软件构建药物-靶点-疾病网络图，如图2。该网络图中共包含156 节点（其中药物节点4 个，疾病节点1 个，有效成分节点101 个，靶点节点50 个），623 条边。蓝色代表靶点，黄色代表药物人参及其对应有效成分，粉色代表干姜，紫色代表附子，绿色代表甘草。此网络图中，边代表相互作用关系，一个节点与其他节点连线越多代表相互作用关系越多，则该节点度值越高，证明该节点在疾病治疗过程中越关键。通过对该网络可视化分析发现，度值较高的有效活性成分包括槲皮素、山奈酚、柚皮素、β-谷甾醇等，说明这些化合物是发挥疾病治疗作用的关键化合物。

图2 药物-化合物-靶点网络图Fig 2 Network diagram of drug-component-target

2.4 PPI 相互关系网络构建结果

将四逆加人参汤治疗COVID-19 潜在作用靶点蛋白导入STRING 构建PPI 网络。得到TSV 文件并导入Cytoscape 3.7.2 进行可视化分析，如图3。图中有50 个节点，708 条边，其中节点代表交集蛋白，图形越大，颜色越深则代表度值（degree）越大，边则表示蛋白间的关联作用。图中节点的平均度值为28.32；中心度（closeness centrality）平均值为0.794；介数（betweenness Centrality）平均值为0.008 9。度值较高靶点分别为白细胞介素-6（IL-6）、丝裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）、丝裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、丝 裂 原 活 化 蛋 白 激 酶1（MAPK1）、TP53、肿 瘤 坏 死 因 子（TNF）、胱 天 蛋 白 酶3（CASP3），提示这些靶点可能是发挥作用的关键靶点。见图4。

图4 四逆加人参汤治疗COVID-19 关键靶点PPI 网络分析Fig 4 Network analysis of key targets of Sini Decoction plus Ginseng for the treatment of COVID-19

2.5 KEGG 和GO 生物过程富集分析结果

GO 富集功能分析包括生物过程（BP）、细胞组成（CC）、分析功能（MF）。将50 个交集基因输入DAVID 数据库进行发现涉及生物过程341 个，细胞组分33 个，分子功能50 个。设置P＜0.05，各选取前20 个条目，运用OmicShare 平台制作气泡图。见图5～7。其中横坐标表示富集因子，纵坐标表示GO 条目名称。颜色代表P-value，颜色越红，该值越小。气泡大小表示富集的基因个数，气泡越大表示富集的基因个数越多。

图5 生物过程富集分析Top20Fig 5 Top 20 enrichment of biological process

将50 个交集基因输入DAVID 数据库进行KEGG 信号通路富集功能分析，共有112 条信号通路。基于KEGG 信号通路结果并结合文献，筛选后共得出与COVID-19 相关的信号通路20 条。见图8。包括TNF 信号通路、结核、甲型流感、HTLV-1 感染、p53 信 号 通 路、PI3K-Akt 信 号 通 路、HIF-1 信 号通路、MAPK 信号通路、NF-κB 信号通路、NOD 样受体信号通路、VEGF 信号通路、FoxO 信号通路、Toll 样受体信号通路等。

图8 KEGG 通路信息图Fig 8 Diagram of KEGG signaling pathway

图6 细胞组成富集分析Top20Fig 6 Top 20 enrichment of cellular component

图7 分析功能富集分析Top20Fig 7 Top 20 enrichment of analysis function

2.6 成分-靶点-通路网络图构建结果

为了更加清晰地展现药物成分、疾病靶点与通路的关系，构建成分-靶点-通路网络图。见图9。该网络图中一共有182 个节点，包括活性成分节点112个，靶点节点50 个，通路节点20 个，534 条边。该网络图中，度值较高的通路分别为结核、甲型流感、TNF 信号通路、MAPK 信号通路、Toll 样受体信号通路、PI3K-Akt 信号通路、HIF-1、NF-κB 信号通路。度值较高的靶点分别为PTGS2、NOS2、MAPK14、RELA、MAPK1、NOS3、MAPK3、TNF、IL-6 等。度值较高的活性成分分别为槲皮素、山奈酚、柚皮素、β-谷甾醇等。

图9 成分-靶点-通路网络图Fig 9 Network diagram of component-target-pathway

3 讨论

国家及多省市卫健委发布的关于新冠肺炎诊疗方案中，肺炎（危）重症患者内闭外脱证临床表现为神昏、烦躁、胸腹灼热、手足逆冷、呼吸急促或急需辅助通气。其他症状包括舌质紫绛，苔黄褐或燥，脉浮大无根［4］。推荐用药为参附注射液、血必净注射液、四逆加人参汤、麻杏甘石汤等。研究表明参附注射液可通过调节机体免疫和炎症反应发挥对COVID-19 的治疗作用［5］。血必净注射液可通过调节人体免疫炎症反应来保护重要器官，通过作用于病毒必需蛋白3CL 水解酶及其人体受体血管紧张素转换酶-2（ACE2）而产生一定的抗病毒作用［6］。麻杏甘石汤可通过炎症通路、抑制细胞因子风暴，免疫调节等多条途径治疗COVID-19［7］。四逆加人参汤具有回阳救逆、益气固脱的功效，但作为新冠肺炎重症者推荐用药其作用机制尚不明确。本文通过网络药理学分析，初步阐释了其可能作用的分子机制。

本研究表明，四逆加人参汤治疗COVID-19 发挥作用的主要成分为槲皮素、山奈酚、柚皮素、β-谷甾醇。槲皮素属于黄酮类化合物，有较为广泛的药理作用，包括抗炎抗菌、抗氧化、抗肿瘤及保护心肌再灌注损伤等［8］。研究表明，槲皮素对SARS-CoV 3CL 有抑制作用［9］。槲皮素可显著地抑制脂多糖（LPS）诱导RAW264.7 细胞后NO、TNF-α、IL-1β以及IL-6 含量的升高，从而起到抗炎效果［10］。研究表明，槲皮素与ACE2 有良好的结合力，可通过抑制ACE、AngⅡ，促进ACE2 水平来抑制心室重构和纤维化［11］。贾庆运等［12］的研究表明，槲皮素可抑制NF-κB 的 磷 酸 化，下 调TNF-α 诱 导 的MH7A 细 胞IL-1β、IL-6、IL-8 的表达。因此推测，槲皮素可能通过抑制炎症反应的发生，保护心肌再灌注损伤等改善重型新冠肺炎患者急性呼吸窘迫、多器官衰竭等临床症状。山奈酚可通过Erk 和Nf-κB 途径调节氧化应激、炎症和细胞凋亡。柚皮素可通过抑制NLRP3 炎症小体的激活，降低炎症水平［13］。β-谷甾醇可显著抑制LPS/Gal N 诱导的Toll 样受体4（TLR4）和NF-κB 的高表达，降低了TNF-α、IL-1β和IL-6 的水平［14］，抑制炎症反应的发生，从而减少因新冠肺炎引起的肺损伤的发生。

通过PPI 网络，筛选出四逆加人参汤治疗COVID-19 的 关 键 靶 点7 个，分 别 为IL-6、MAPK8、MAPK3、MAPK1、TP53、TNF、CASP3。研 究 表明，SARS-CoV-2 与ACE2 过度结合，机体的过度免疫应答，产生了大量细胞因子，从而引起细胞因子风暴，导致急性肺损伤（ALI）、急性呼吸窘迫综合征（ARDS）及多器官衰竭等，所以调节炎症反应及免疫应答至关重要［15］。作为炎性细胞因子，IL-6、TNF 通过自分泌、旁分泌及全身作用等方式参与炎症反应而发挥疾病治疗作用。IL-6 是一种炎症反应的促发剂，它可以通过诱导B 细胞分化、产生抗体及T 细胞增殖分化，从而参与免疫应答，还可通过激活NF-κB 信号通路，促进炎症因子的释放，从而导致细胞因子风暴的产生［16］。TNF 可促进内皮细胞粘附因子的表达分泌并促使白细胞与之黏着，还能激活间质组织蛋白水解酶的释放及中性粒细胞的聚集，从而发挥疾病治疗作用［17］。冯碧红等［18］的研究表明，肺部被流感病毒感染后，中性粒细胞和单核细胞被致炎因子激活，释放炎性细胞因子如TNF、IL-6 等，促使机体炎症反应的发生及组织的损伤。MAPK8、MAPK3、MAPK1 均属于丝裂原蛋白活化激酶（MAPK）家族。MAPK 是一个多功能的信号家族，包括三大主要的功能家族，即ERKs、JNKs 和p38。MAPK 可被上游激酶活化并磷酸化，从而活化下游因子，发挥调节细胞增殖、分化及死亡的作用［19］。研究表明，MAPK 是ALI 中炎症反应的关键调节剂，通过靶向MAPK1 表达可减弱LPS诱导的ALI［20］。程海飞等［21］的研究表明，ALI 过程中MAPK 信号通路通过调节下游产物活性，影响炎症细胞黏附血管内皮，在炎症部位激活并释放炎症因子以及凋亡过程，调控MAPK 信号通路的活性可影响ALI 进展。TP53 作为一种肿瘤抑制因子，可调节细胞周期，起到炎症抑制作用［22］。研究发现，肺泡Ⅱ型上皮细胞被BCG 感染时，P53 可通过抑制TNF-α 介 导 细 胞 死 亡［23］。王 媛 等［24］的 研 究 发 现，BCG 感染A549 细胞时，p53 信号通路中的p53 协同p300 来 抑 制NF-κB、TLR-4 和TRAF6 的 活 化 及 负调控TNF-α、IFN-γ、IL-6 和IL-8 的分泌，从而抵抗MTB 的侵染。CASP3 是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，Sun 等［25］的研究表明，抑制CASP3 的激活可减少PRRSV 诱导的细胞凋亡。以上研究表明，四逆加人参汤可通过对以上因子的调节参与炎症反应介导炎性因子的释放，调节机体免疫增加机体对病毒的抵抗，从而介导机体ALI 及ARDS进程。

GO 富集分析涉及炎症反应、细胞对脂多糖的反应、LPS 介导的信号通路、外源性凋亡信号通路、RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、细胞因子活性、趋化因子活性，血红素结合等。炎症反应是机体应对刺激产生TNF、IL、趋化因子、IFN 等促炎性因子的一种反应，可因过度激活而产生细胞因子风暴，从而导致组织器官损伤、器官衰竭。研究结果提示，COVID-19 的始动因素是SARS-CoV-2 感染。研究人员推测SARS-CoV-2 感染后激活免疫细胞，释放TNF-α、IL-1、干扰素、趋化因子等，介导大量免疫细胞向肺组织聚集浸润，同时激活细胞信号转导通路，启动瀑布式炎症级联反应，释放大量细胞因子，并不断激活更多的炎症细胞，形成恶性循环，最终导致细胞因子风暴［26］。SARS-CoV-2 作为一种RNA 病毒，通过对RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的调控，从而影响RNA 病毒的复制［27］。LPS 可与Toll样受体4 结合，通过NF-κB 信号通路介导炎性因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 的表达，其诱导的炎症反应可促进ALI 的发生发展［28，29］。基于KEGG 信号通路并筛选得到结核、甲型流感、TNF 信号通路、MAPK信号通路、Toll 样受体信号通路、PI3K-Akt 信号通路、HIF-1 信 号 通 路、NF-κB 信 号 通 路 等。TNF 信号通路在炎症反应及抑制细胞因子风暴中起重要作用［30］。MAPK 信号通路及TNF 信号通路可通过减轻过度免疫应答从而减轻炎症反应。Toll 样受体是一种信号分子识别受体，可通过调节免疫从而产生抗病毒作用，还能通过诱导多种炎症因子的分泌从而参与炎症反应［31］，此外与肺纤维化的发生发展关系密切［32］。NF-κB 信号通路参与炎症反应、免疫应答及细胞凋亡等多个过程，NF-κB 的活化可促进疱疹病毒的复制［33，34］。四逆加人参汤通过对以上生物过程及通路的调节参与机体炎症反应及免疫调节过程，从而介导机体内细胞因子风暴的产生，影响ARDS 及多器官衰竭进程。

本研究通过运用网络药理学的方法，初步分析了四逆加人参汤治疗新冠肺炎的作用机制。四逆加人参汤含有槲皮素、山奈酚、柚皮素、β-谷甾醇等活性成分，可通过TNF 信号通路、MAPK 信号通路、Toll 样受体信号通路、PI3K-Akt 信号通路、HIF-1 信号通路等通路作用于IL-6、MAPK8、MAPK3、MAPK1、TP53、TNF、CASP3 等靶点，富集在炎症反应、细胞对脂多糖的反应、脂多糖介导的信号通路、外源性凋亡信号通路、RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、细胞因子活性、趋化因子活性，血红素结合等多个生物过程。由此可得知，四逆加人参汤治疗新冠肺炎是多成分、多通路、多靶点共同作用的结果。然而，本研究仅从理论上分析其机制，中药剂量及煎煮、新冠肺炎数据库尚不完善等问题可能会对本结果造成一定的影响，接下来还需进一步实验验证，从而为COVID-19 的中医药治疗提供更加直接有力的证据。