杜仲、大血藤、鸡血藤和桑黄四种中药提取物的抗痛风作用研究

吴昊霖，蔡来燕，樊好飞，方星悦，徐怡倩，虞道锐，唐晓亮，刘启兵，2

（1. 海南医学院基础医学与生命科学学院药理学教研室，海南 海口 571199；2. 海南省热带脑科学研究与转化重点实验室，海南 海口 571199）

痛风性关节炎是由于周围组织中沉积尿酸钠（monosodium urate，MSU）晶体引起的一种自身炎症反应，最常见于关节内和关节周围［1］。据报道，痛风还与其他疾病相关，包括心血管疾病、慢性肾病、肥胖和2 型糖尿病等相关。此外，最近的研究表明痛风是心血管疾病的独立危险因素之一。别嘌呤醇、非布索坦、秋水仙碱和苯溴马隆等合成类药物可减轻尿酸沉积造成的炎症和疼痛，而被广泛应用。然而，这些降低尿酸盐的化合药物都有一定急慢性不良反应，如恶心、皮疹、过敏、肝转氨酶升高和肝毒性等［2，3］。因此，迫切需要开发安全系数高的痛风治疗药物。此前，多项研究显示，天然产物对痛风具有良好的治疗效果，有报道显示植物提取物及其分离的成分在体外和体内均有抗痛风活性和抗炎作用［4］。其中，中医特有药材杜仲（Eucommmia ulmoidesOliver）、大血藤（Sargentodoxa cuneataOliv.Rehd.et Wils.）、鸡 血 藤（Spatholobi caulis）和 桑 黄（Phellinus igniarius）的抗氧化、镇痛、抗炎的研究多有报道，同时也有研究表明这四种中药抗炎作用与IL-1β 有关［5-9］。然而目前对这四种中药的研究多集中在类风湿性关节炎，其对急性痛风性关节炎的研究略有欠缺。本文采取水提法提取四种药材，并利用MSU 制造小鼠急性痛风性关节炎模型，旨在探究杜仲、大血藤、鸡血藤和桑黄四种中药提取物的抗痛风效果，为临床治疗痛风提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF 级雌性昆明种小鼠，重量（25±5）g，由海南医学院药物安全评价中心提供，实验动物生产许可证号：HNXK（琼）2019-0018。

1.2 药物与试剂

杜仲、大血藤、鸡血藤、桑黄中药提取物自制；秋水仙碱片，Macklin 公司（批号C10855147）；尿酸钠，Sigma 公司（批号BCBS7438）；大、小鼠IL-1β ELISA 检测试剂盒，Servicebio（批号GM1153）。

1.3 仪器

RB-200 智能热板仪（成都泰盟软件有限公司）；AL204 电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；迈瑞兽用全自动血液细胞分析仪（BC-2800vet）。

1.4 中药提取物制备

杜仲、大血藤、鸡血藤和桑黄各精确称量1 kg干品，加2 L 蒸馏水回流提取2 次，每次1 h。合并提取液，真空减压浓缩至0.2 L。

1.5 实验分组与给药

小鼠正常喂饲2 周，取70 只小鼠随机分为7 组，每组10 只，分别为正常组、模型组、秋水仙碱组、鸡血藤组、大血藤组、桑黄组、杜仲组，置于温度为（55.0±5）℃热板上进行痛敏筛选，舔后足时间小于5 s 、大于30 s 或跳跃频繁的小鼠不予采用，最终各组取6 只合格小鼠进行实验。将浓缩后的鸡血藤水溶液、大血藤水溶液、桑黄水溶液、杜仲水溶液，灌胃给药（2×10-4L/只），正常组给予生理盐水灌胃（2×10-4L/只），秋水仙碱组、鸡血藤组、大血藤组、桑黄组和杜仲组均配置0.4 mL/mg 水溶液（0.2 mL/只）灌胃给药10 天，并于末次给药1 h 后造模。造模后停止药物干预。

1.6 造模

将MSU 用无菌生理盐水配成50 g/L 的MSU混悬液。水合氯醛麻醉小鼠，将右侧踝关节稍微弯曲，手可明显触摸到两骨突起并用4.5 号注射针在突起间隙之间进针，此时有漏空感，即证明注射到关节腔内。正常组小鼠右踝关节每只注射1×10-4L生理盐水，模型组、秋水仙碱组、鸡血藤组、大血藤组、桑黄组、杜仲组每只小鼠注射1×10-4LMSU 混悬液。建模后每组小鼠的右后踝关节肿胀，则初步定义为建模成功。

1.7 足跖肿胀观察

分别于致炎前后测定右后足跖直径。观察和测定注射后24 h 小鼠右后足跖肿胀情况、体重和痛阈值，计算小鼠关节直径比。

1.8 痛阈值观察

42 只小鼠造模成功后，于24 h 和36 h 测定各组小鼠痛阈值，以小鼠舔后足时间作为观察指标，1 min 内舔后足的小鼠按实际舔足时间计入痛阈值，1 min 未有舔后足反应者，以1 min 计入痛阈值［10］。

1.9 小鼠血液分析

1.9.1 全血样本 小鼠眼球取血，取适量抗凝全血样本装入EDTA 抗凝管，EDTA 与全血充分混匀。1.9.2 血清样本 全血于室温放置2 h 后于2～8 ℃，3 000 r/min 离心15 min，取上清液立即检测。IL-1β 检测参照ELISA 试剂盒说明书。

1.9.3 血浆样本 全血采集后30 min 内于2～8 ℃3 000 r/min 离心15 min，取上清液立即检测。用迈瑞兽用全自动血液细胞分析仪分析血液报告。

1.10 小鼠踝关节病理分析

取踝关节周围的关节组织，用4%多聚甲醛固定，经石蜡包埋制备成5 μm 组织切片，经脱蜡复水、抗原修复、免疫反应后加入苏木素伊红染液染色，脱水封片，在倒置光学显微镜下观察关节形态变化。

1.11 统计学处理

数据使用SPSS19.0 统计学软件进行处理，计量数据用（±SEM）表示，两组间比较采用配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组小鼠左右足趾对比

由图1 可见，正常组左右足对比未见明显形态学改变。模型组和中药提取物各组小鼠右足趾均可见不同程度的肿胀，和模型组比较，鸡血藤组形态学变化最轻，杜仲和大血藤组次之，桑黄组肿胀较为明显。

图1 各组小鼠左右足形态对比Fig 1 Changes comparision between the left and right toes of the experimental mice

2.2 四种中药提取物对小鼠体重的影响

由图2 可见，预防给药前各组小鼠（F＝1.699，P＞0.05）与预防给药10 d 后（F＝2.137，P＞0.05）体重无明显差异。

图2 四种中药提取物对MSU 引起痛风小鼠模型体重的影响Fig 2 The effect of four herb extracts on the body weight of mice models of gout induced by MSU

2.3 四种中药提取物对MSU 致小鼠关节直径的影响

由图3 可见，与正常组比较，模型组小鼠24 h 关节直径比（t＝5.086，P＜0.01）显著升高。与模型组比较，秋水仙碱组（t＝11.18，P＜0.05）、杜仲组（t＝4.969，P＜0.05）、大血藤组（t＝3.379，P＜0.05）和鸡血藤组（t＝4.489，P＜0.05）在24 h 小鼠关节直径比明显降低，差异有统计学意义。鸡血藤组在24 h 降低关节直径最为明显，杜仲组次之。桑黄组（t＝0.986 6，P＞0.05）保护效果较弱，和模型组比较，差异无统计学意义。

图3 四种中药提取物对MSU 所致小鼠关节直径的影响Fig 3 The effect of four herb extracts on the joint diameter of mice models of gout induced by MSU

2.4 四种中药提取物对小鼠镇痛作用的影响

图4、5 可见，与正常组比较，24 h（t＝3.967，P＜0.05）和36 h（t＝2.937，P＜0.05）模型组的痛阈值分别为27.2 s 和32.75 s，痛阈值明显下降。与模型组比较，24 h 杜仲组（t＝2.893，P＜0.05）和大血藤组（t＝2.605，P＜0.05）痛阈值明显升高，差异有统计学意义；鸡血藤组（t＝1.255，P＞0.05）与模型组比较，痛阈值有一定的升高，但由于组内差异较大，无统计学意义。36 h 时杜仲组（t＝4.952，P＜0.05）和鸡血藤组（t＝2.835，P＜0.05）的痛阈值明显升高，和模型组比较差异有统计学意义，其中杜仲组镇痛效果甚至优于秋水仙碱组。

图4 四种中药提取物24 h 对MSU 所致小鼠痛阈值的影响Fig 4 The effect of four herb extracts on the 24 h pain tolerance of mice models of gout induced by MSU

图5 四种中药提取物36 h 对MSU 所致小鼠痛域的影响（n＝6，±SEM）Fig 5 The effect of four herb extracts on 36 h pain tolerance of mice models of gout induced by MSU

2.5 四种中药提取物对小鼠血液中白细胞、单核细胞、中性粒细胞和IL-1β 表达水平的影响

和模型组比较，杜仲组（t＝4.681；t＝2.31；t＝3.252）和鸡血藤组（t＝4.895；t＝2.466；t＝3.752）能明显减小血液中的白细胞、单核细胞和中性粒细胞数量（P均＜0.05），见表1。鸡血藤组对三种细胞的影响较为明显。杜仲组（t＝2.9）、大血藤组（t＝4.0）和桑黄组（t＝3.4）的IL-1β 水平均显著降低，和模型组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），但鸡血藤未能明显抑制IL-1β 的表达水平。

表1 四种中药提取物对小鼠血液中白细胞、单核细胞、中性粒细胞和IL-1β 表达水平的影响（n＝6，±SEM）Tab 1 The effects of four herb extracts on the expression levels of leukocytes，monocytes，neutrophils and IL-1β expression in the blood of mice（n＝6，±SEM）

表1 四种中药提取物对小鼠血液中白细胞、单核细胞、中性粒细胞和IL-1β 表达水平的影响（n＝6，±SEM）Tab 1 The effects of four herb extracts on the expression levels of leukocytes，monocytes，neutrophils and IL-1β expression in the blood of mice（n＝6，±SEM）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05。

剂量组别单核细胞（109/L）正常组模型组秋水仙碱组杜仲组大血藤组鸡血藤组桑黄组IL-1β（pg/mL)12.61±6.25 89.71±44.35**24.39±11.44#37.84±11.05#27.15±0.73#95.47±27.34 31.83±8.61#9.412 0.000 3－2.5 mg/只0.1 mg/kg 0.2 mL/只0.2 mL/只0.2 mL/只0.2 mL/只FP白细胞（109/L）5.34±0.91 13.32±3.34**4.20±0.59#6.00±0.28#5.40±1.29#4.60±1.76#8.30±2.52#13.48＜0.000 1 0.16±0.05 0.58±0.34**0.30±0.17 0.18±0.07#0.44±0.30 0.16±0.05#0.30±0.06 2.86 0.026 2中性粒细胞（109/L）0.94±0.22 2.86±1.09**1.20±0.63#1.04±0.27#1.56±0.80 0.76±0.27#1.62±0.56 5.145 0.001 1

2.6 对小鼠左侧踝关节组织病理变化的影响

由图6 可见，正常组未观察到炎症细胞浸润；模型组小鼠出现炎性细胞浸润，秋水仙碱组明显改善并降低炎性细胞浸润；杜仲组、大血藤组、鸡血藤组和桑黄组均明显改善炎性细胞浸润和水肿，滑膜层细胞部分恢复正常，其中鸡血藤组改善效果最明显。

图6 四种中药提取物对小鼠左侧踝关节组织病理变化的影响（H &E，×10）Fig 6 The effect of four herb extracts on the pathological changes of the left ankle joint in mice（H &E，×10）

3 讨论

急性痛风性关节炎是由于尿酸盐晶体沉积于关节及其周围组织而引起的炎症反应性病症［4］。炎症是机体对内源或外源性刺激引起组织损伤的一种复杂病理反应，主要通过单核巨噬细胞、中性粒细胞和白细胞分泌多种与组织炎症有关的促炎性细胞因子，包括肿瘤坏死因子（TNF-α）、IL-1β 等，这使得它们成为多种疾病治疗干预的关键靶点［11］。

大多数传统的抗痛风药都有副作用，如心血管和胃肠道不良反应，因此，探索新的、有效的、安全的抗炎治疗方法迫在眉睫［2，3］。中药提取物具有显著的抗炎、免疫调节和抗肿瘤作用。而且大多数中药提取物对人和动物都相对安全。近年来，中药提取物由于其安全性、抗炎镇痛效果和免疫调节特性而受到广泛关注［11］。将MSU 混悬液注射于小鼠的踝关节腔内，形成局部范围如关节滑膜、软骨等组织短时间内MSU 沉积而刺激关节产生炎症是目前较好的痛风关节炎造模方式之一［1，12］，本实验采用上述方法成功制造痛风性小鼠模型。Pope 等［13］发现，MSU 对关节液和血液中含有的单核细胞与吞噬细胞产生刺激作用，并释放大量的炎症因子IL-1β。IL-1β 是痛风炎症的核心蛋白，主要由单核细胞和巨噬细胞产生［2］，其通过刺激促炎性细胞因子、趋化因子和内皮细胞黏附因子上调，导致炎症细胞（如中性粒细胞和单核细胞）的募集，降解软骨基质，从而导致软骨吸收和骨破坏，同时引发剧烈疼痛、水肿 等 症 状，进 而 加 剧 痛 风 相 关 炎 症［14，15］。同 时，MSU 在痛风发作期间诱导溶酶体和细胞膜溶解、白细胞的额外募集和炎症介质的进一步释放，导致持续性炎症［2］。Gao 等［16］研究发现杜仲提取物具有促进胶原合成和保护软骨的作用，Guo 等［11］研究发现大血藤多糖有较好的抗炎疗效，Cheng 等［17］通过体外实验发现鸡血藤水提取物可以靶向NF-κB 发挥抗炎作用和减轻氧化应激。Ku 等［18］表明桑黄多糖可以改善脂多糖诱导的炎症。本实验通过ELISA试验和全血分析重点监测了IL-1β 的表达水平以及单核细胞、白细胞和中性粒细胞的数量，验证了杜仲、大血藤和桑黄通过抑制IL-1β 发挥抗炎作用并且杜仲抑制IL-1β 的效果明显。应用痛风经典检测手段关节直径比和痛阈值验证四种中药提取物的镇痛消肿作用，发现鸡血藤虽然具有较好的镇痛和消肿效果，并且通过病理组织切片进一步证实其在改善炎细胞浸润、水肿和滑膜层细胞上的治疗效果，但未能抑制IL-1β 的表达水平，说明鸡血藤有着良好的抗炎镇痛作用和治疗痛风的潜力，但可能并不作用于IL-1β。从关节直径比、痛域值对比发现，大血藤疗效明显，其持续效果很好，桑黄虽然也有部分抗炎镇痛作用，也有研究报道了其在类风湿关节炎上的治疗潜力［8］，但本次实验发现其对于急性痛风性关节炎的疗效不佳。

本实验提取的杜仲、大血藤、鸡血藤和桑黄制剂所含成分较多且复杂，因此仍需进一步分离纯化验证是哪一类活性物质对抗痛风作用疗效更好，以及探讨何种浓度中药提取物能发挥最大疗效。

作者贡献度说明：

吴昊霖：参与实验，撰写论文；蔡来燕：参与实验，整理数据；樊好飞：指导实验，参与实验；方星悦：参与实验，购买耗材；徐怡倩：参与实验，整理数据；虞道锐：参与实验，提供实验器材；唐晓亮：确定实验所需中药，提取中药有效成分；刘启兵：指导实验，参与实验，修改论文。