混合型饲料添加剂中绿原酸检测方法的建立及应用

李志娟，付 坤，丁 涵

（1.河南国康检测技术有限公司，河南 郑州 450003；2.河南中德检测技术有限公司；3.河南省家禽业协会）

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 混合型饲料添加剂：杜仲叶提取物原料，购自无锡正大生物股份有限公司。

1.1.2 绿原酸标准品：纯度大于98.0%，FirstStandard公司。

1.1.3 磷酸：分析纯，购自天津市福晨化学试剂厂。

1.1.4 甲醇、乙腈：色谱纯，sigma。

1.2 主要仪器与设备

1.2.1 高效液相色谱仪（配紫外检测器）：美国Waters公司Waters2695；紫外检测器2487。

1.2.2 反向色谱柱：美国WatersC18柱（250mm×4.6mm）。

1.2.3 分析天平：BT125D，感量0.00001g，赛多利斯。

1.3 方法

1.3.1 标准储备液的制备

沙朗舞的脚下动作可分为四组：（一）单步的顺边移动；（二）双脚自然迈步旁移，而且在单脚跳步的同时小腿带动脚腕儿发力；（三）右脚为主动脚，右脚跳出，左脚跟上，身体重心伴随脚步的变换而转移；（四）脚腕儿主动发力突出往回勾脚，左、右侧点地，同时快速转换身体重心。四组不同的脚下动作共同构筑成一套完整的舞蹈短句，并以此短句为舞动单位，进而循环往复。舞段结束时，大家会在领舞的带动下放开双臂，交换舞步，形成新的舞蹈段落。每次跳沙朗舞大家都至少要跳出十几个不同的舞段，舞段变换越丰富，大家的积极性就会愈发高涨。

精密称取绿原酸对照品10mg（精确至0.0001g），置于10mL棕色量瓶中，加甲醇溶液溶解并定容至刻度，摇匀，即得。-20℃冰箱中保存，有效期6个月。

1.3.2 试样的制备与保存

称取本品适量（约相当于绿原酸10mg，精确至0.0001 g），置于100mL棕色量瓶中，加甲醇溶液溶解并定容至刻度，充分摇匀，过滤，弃去初滤液，取续滤液作为试样溶液。

1.3.3 质量控制样品的制备

1.3.3.1 空白样品 取空白试样，与待测试样同步处理。

1.3.3.2 添加样品 取空白试样1.0g（精确至0.0001g），添加1000μg/mL的标准中间工作液1.0mL，制得浓度为1000mg/kg的阳性添加试样，与待测试样同步处理。

1.4 仪器参数与测定

色谱条件优化：色谱柱：美国WatersC18柱（25cm×4.6 mm）；柱温：40℃，流动相：乙腈：0.4%磷酸溶液=13:87；流速1.0mL/min，进样量：20μL。紫外检测器，波长327nm。

1.5 线性关系分析

准确量取绿原酸标准溶液，用甲醇稀释成浓度分别为4.00、5.00、10.00、20.00、30.00、40.00μg/mL的系列标准工作液，在上述色谱条件下进行测定，绘制标准曲线，以浓度为横坐标，以样品的峰面积为纵坐标，计算回归方程、分析线性范围。

1.6 精密度试验

取适量绿原酸对照品溶液，在上述色谱条件下连续进样6次（进样量为20μL），检测其峰面积和保留时间，计算RSD值。

1.7 重复性试验

取同批次的样品杜仲叶提取物，制备6份样品溶液，按上述过程进样20μL进行检测，计算绿原酸的RSD值。

1.8 样品检测

随机抽检市场委托的混合型饲料添加剂杜仲叶提取物5份，采用该文建立的方法测定其中绿原酸的含量。

2 结果与分析

2.1 线性关系、检出限结果

该研究采用甲醇配置质量浓度5～40μg/mL的绿原酸标准溶液，按所建立的液相色谱条件进行测定，线性关系良好，线性方程y=60518.31x-12230.03（R2=0.999859），采用标准添加法，方法检出限1mg/kg。

2.2 添加回收率试验结果

5个样品中，绿原酸的平均回收率80.2%～96.7%，说明方法所得结果的回收率满足实验要求，符合定量分析，其回收率和精密度结果详见表1。

表1 绿原酸的加标回收率

2.3 精密度试验结果

精密度试验结果峰面积RSD值为0.104%，保留时间RSD值为0.011%，表明该方法精密度良好。结果见图1。

图1 绿原酸精密度试验结果

2.4 重复性试验结果

重复性试验结果RSD值为0.22%，表明该方法重复性良好。结果见图2。

图2 绿原酸重复性实验结果

2.5 方法应用结果

对市场委托的5份混合型饲料添加剂杜仲叶提取物，采用该文建立的方法测定其中绿原酸的含量，质控加标回收率均在80.2%～96.7%，说明本方法回收率良好，检测结果准确。

3 讨论与结论

该研究建立了一种专门用于混合型饲料添加剂—杜仲叶提取物中绿原酸含量的高效液相色谱检测方法，通过摸索样品前处理的方法和液相色谱的检测条件，建立了快速简便检测混合型饲料添加剂中绿原酸含量的液相色谱方法。结果表明，样品前处理方法只需甲醇溶液溶解定容即可；上机条件为：采用WatersC18（250mm×4.6mm）色谱柱，流动相乙腈：0.4%磷酸溶液=13:87洗脱，流速1.0mL/min，进样量20μL，波长327nm，可以获得良好的峰面积，该方法检测限为1mg/kg；通过标准曲线的建立，表明该研究所建立的方法线性关系良好，线性方程y=60518.31x-12230.03（R2=0.999859）；该方法在2～10mg/kg添加浓度的平均回收率为81.2%～99.7%，精密度RSD≤3.6%。通过在5份混合型饲料添加剂的检测应用，表明该方法能够达到准确、快速、简便、回收率高的特点，适用于混合型饲料添加剂中绿原酸的检测。该研究的精密度试验、重复性试验、线性关系均良好，回收率可以达到相关研究的规定水平，该方法可以准确客观地检测出产品中的绿原酸有效成分，这为提高混合型饲料添加剂中绿原酸有效成分的检测技术水平具有重要的意义，也为饲料安全监管部门提供了一个快速且准确的定量检测方法。□