甘薯丝裂原活化蛋白激酶MPK6对低温胁迫的响应

靳容，刘明，赵鹏，张强强，张爱君，唐忠厚

甘薯丝裂原活化蛋白激酶对低温胁迫的响应

靳容，刘明，赵鹏，张强强，张爱君，唐忠厚*

江苏徐淮地区徐州农业科学研究所/江苏徐州甘薯研究中心/农业部甘薯生物学与遗传育种重点实验室，江苏徐州 221131

【目的】研究甘薯丝裂原活化蛋白激酶在抵御低温胁迫过程中的功能，为解析甘薯耐低温机制和遗传改良提供参考。【方法】采用农杆菌介导法，将35S::重组表达载体和对照载体质粒pDMC83转化甘薯愈伤组织，根据载体上特有的序列设计引物对甘薯拟转基因材料进行分子鉴定，并通过qRT-PCR筛选表达量高的转基因株系。对非转基因植株（WT）和转基因株系进行低温胁迫和恢复处理，观察处理后及恢复后的表型变化；检测叶绿素荧光参数Fv/Fm、丙二醛（MDA）含量和过氧化氢（H2O2）含量等生理指标；利用二氨基联苯胺（DAB）和氮蓝四唑（NBT）染色法观察活性氧的积累情况；分析低温信号转导途径中关键转录因子基因和下游基因的表达水平。【结果】共获得12株过表达甘薯株系，筛选表达量最高的3个过表达株系（L3、L8和L11）用作低温胁迫分析材料。低温胁迫下WT的Fv/Fm为0.50，而转基因株系L3、L8和L11的Fv/Fm分别为0.79、0.79和0.80，与WT呈现极显著差异水平。温度恢复后，转基因植株中Fv/Fm恢复至低温处理前水平，而WT中Fv/Fm仅为0.70，极显著低于转基因植株。低温胁迫下，WT的丙二醛含量为0.05 μmol·g-1，而转基因株系L3、L8和L11中的丙二醛含量分别为0.02、0.04和0.02 μmol·g-1，显著低于WT。温度恢复正常后，WT中的丙二醛含量为0.03 μmol·g-1，而转基因株系L3、L8和L11中的丙二醛含量均为0.01 μmol·g-1。DAB和NBT染色结果显示，低温胁迫下，WT叶片与转基因株系叶片相比，染色较深，说明WT比转基因植株积累了更多的过氧化氢和超氧阴离子。过氧化氢含量测定结果显示，低温胁迫下和温度恢复后，转基因植株中过氧化氢的含量均显著低于WT。qRT-PCR结果表明和受低温诱导表达，且在WT和转基因株系之间差异显著。【结论】过表达甘薯植株通过缓解光合系统和膜系统的损伤、减少活性氧的积累，提高了对低温胁迫的耐受性。通过调控低温通路中相关基因和的表达，参与甘薯低温信号转导途径。

甘薯；；转基因株系；低温胁迫

0 引言

【研究意义】温度是植物生长发育过程中最重要的环境因素之一，不仅影响农作物的生长发育和产量，也制约农作物的耕作时间和地理分布[1]。甘薯（(L.) Lam.）是世界上第七大粮食作物，然而，不论苗期生长还是收获后储藏都对低温都非常敏感，甘薯的不耐低温性严重制约了甘薯产业的发展[2-3]。克隆和低温应答相关的基因并阐释其功能，对开展基因靶向育种和改良甘薯耐低温胁迫的能力具有重要的理论意义。【前人研究进展】有丝分裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是广泛存在于真核生物中的信号分子，由MAPKKK、MAPKK和MAPK组成，通过级联依次磷酸化反应方式参与胞外信号的放大和胞内信号的传递，参与生物或非生物的胁迫反应、激素反应、细胞分裂、生长发育与程序性凋亡等[4-6]。目前仅有少数的MAPK级联反应被详细报道，其中，拟南芥MEKKK1-MKK2-MPK4/MPK6级联反应和水稻OsMKK6-OsMPK3级联反应参与植物低温信号转导途径[7-8]。异源或同源过表达MAPK级联信号中的激酶可以提高植物耐低温性。突变MKK2的磷酸化位点，在拟南芥中过表达该突变基因MKK2，抑制其蛋白磷酸化活性，提高了拟南芥的耐低温性[9]；在烟草中分离到一个拟南芥的同源基因，分别在烟草和玉米中过表达该基因，可以提高烟草和玉米的耐低温性[10-11]；在拟南芥中异源表达玉米，可以提高拟南芥耐低温和耐盐性[12]；在烟草中过表达马铃薯或玉米，可通过增加可溶性糖和脯氨酸含量，增加烟草耐低温性[13-14]。拟南芥中共有20个MAPK，目前，研究较为详尽的MAPK激酶有MPK3、MPK4和MPK6。根据序列磷酸化位点的保守性，MPK6和MPK3序列最为相近，功能也相似，同属于A类MAPK，均参与植物生长发育并响应多种生物和非生物胁迫[4,15]。在拟南芥中，响应茉莉酸和乙烯信号传导、参与病原菌应答、调控气孔发育、参与植物抗毒素的合成等。低温胁迫、渗透胁迫和盐胁迫等非生物胁迫均能够诱导拟南芥、水稻和玉米等多种植物中的表达[16-18]。在甘薯中，IbMPK6含有11个保守的亚结构域和磷酸化基序TEY。IbMPK6激酶活性可以被早期的NaCl、SA、H2O2和ABA诱导。在烟草中瞬时过表达，可以提高病原相关（protection related，PR）基因的表达水平，增强叶片对细菌病原菌的耐受性[19]。以上数据表明在调控甘薯逆境胁迫的反应过程中可能起着重要的作用。【本研究切入点】低温胁迫严重影响甘薯产业的发展，但有关甘薯抵御低温胁迫生理和分子机制方面的研究却很少。前人研究发现低温胁迫下的表达随着时间的变化先增后降，在处理30 min时，相对表达量达到顶峰，比处理前增加2.5倍，说明可能参与调控低温信号转导途径[19]。【拟解决的关键问题】本研究通过在甘薯中过表达获得甘薯转基因株系，开展甘薯耐低温性鉴定工作，明确响应低温胁迫的作用，为改良及培育甘薯耐低温品种提供思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

35S::重组表达载体和对照载体质粒pDMC83由韩国生命工学院郭尚姝院士惠赠。大肠杆菌（感受态细胞DH5α、根癌农杆菌（）感受态细胞EHA105由徐州甘薯研究中心保存。

1.2 IbMPK6过表达载体的构建及重组质粒的转化

将重组质粒pDMC83-转化到大肠杆菌DH5α中，接种至含有50 μg·ml-1卡那霉素的LB培养基中，37℃培养1 d，挑取阳性单克隆菌并提取质粒。将提取的质粒转化至根瘤农杆菌EHA105中，接种至YEP培养基（含有50μg·ml-1潮霉素和100 μg·ml-1）中，于28℃培养3 d，挑取单克隆进行PCR检测，筛选阳性克隆，并于-80℃保存备用。PCR检测引物根据全长序列设计（表1）。

1.3 转基因甘薯的分子检测

采用根瘤农杆菌介导法浸染徐薯29胚性愈伤组织。将浸染过的愈伤组织转移至含有20 mg·L-1乙酰丁香酮的MS培养基上，暗培养3 d。用清水去除愈伤组织上残留的根瘤农杆菌，将愈伤组织转移到MS培养基（含有500 mg·L‑1头孢羟氨苄和15 mg·L-1潮霉素）中，光下诱导体细胞胚发生，其间每2周继代1次，直至生成完整的甘薯幼苗植株。提取拟转基因甘薯幼苗叶片的DNA和RNA，用于转基因甘薯植株的分子检测。筛选mRNA表达量最高的3个株系移栽营养土中，并置于人工气候室（28℃、相对湿度75%、光照16 h/黑暗8 h的光照周期）中培养，30 d后选取长势一致的转基因甘薯植株和非转基因对照植株（WT）进行低温胁迫（4℃）处理。低温处理2 d后，把植株再次移入人工气候室中恢复2 d，并进行Fv/Fm、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和过氧化氢（H2O2）含量等生理指标测定。

1.4 叶绿素荧光参数Fv/Fm的测定

分别于低温处理前、低温处理2 d和恢复2 d后，取暗适应30 min后的甘薯植株顶2至顶3完全展开叶，采用LI-6400XT便携式光合测定仪测定PSⅡ最大光化学效率，即暗适应下可变荧光和最大荧光比值（Fv/Fm）。

1.5 丙二醛含量测定

低温处理2 d后取甘薯植株顶3完全展开叶于磷酸缓冲液中研磨成匀浆，离心后取2 ml上清液，加入含有0.5%硫代巴比妥酸的三氯乙酸溶液，水浴加热10 min后迅速冷却，4 000 r/min离心15 min，取上清液于532和600 nm测定吸光值。MDA含量用μmol·g-1表示，计算公式为V×（OD532-OD600）/（V1/V2×155×FW），式中，V为上清液，V1反应液中的提取液数量，V2为提取液，FW为样品鲜重，155为MDA的毫摩尔吸光系数[20]。

1.6 过氧化氢染色分析

采用二甲基联苯胺（dimethylbenzidine，DAB）染色叶片中过氧化氢。将叶片浸泡在0.1% DAB溶液中，并于光下照射6 h。之后将叶片置于95%乙醇中，水浴煮沸，待叶绿素完全脱去，进行拍照观察。

1.7 超氧阴离子染色分析

采用氮蓝四唑（nitro blue tetrazolium，NBT）染色叶片中超阴离子。将叶片浸泡在0.5 mg·mL-1NBT溶液中，抽真空渗透5 min，并放置1 h。之后将叶片置于95%乙醇中，水浴煮沸，待叶绿素完全脱去，进行拍照观察。

1.8 过氧化氢含量测定

低温处理2 d后，取甘薯植株顶3完全展开叶，切碎混匀，称取0.5 g样品，加入1 ml 0.1%（w/v）三氯乙酸研磨，采用碘化钾法测定过氧化氢含量[21]。匀浆低温离心15 min，取上清液0.5 ml，与0.5 ml磷酸缓冲液（0.1 mol·L-1，pH=7.0）和1 ml碘化钾溶液（1 mol·L-1）混合，避光静置1 h后，于390 nm处测定吸光值。过氧化氢含量通过标准曲线计算，用μmol·g-1表示。

1.9 RNA提取和实时荧光定量PCR分析

低温处理3 h后收集转基因甘薯幼苗第三片完全展开叶，液氮速冻后使用RNA快速提取试剂盒（捷瑞，中国）提取RNA，按照TIANSCript Ⅱ RT kit试剂盒（天根，中国）进行反转录，合成cDNA第一条链用于qRT-PCR检测。实时荧光定量PCR总反应体系为模板cDNA 2 μL、上下游引物（表1）各0.4 μL、SYBR PCR Master Mix（TOYOBO, Japan）5 μL和ddH2O 2.2 μL。反应程序为95℃ 3 min；95℃ 3 min 15 s，58℃ 15 s，72℃ 40 s，40个循环。采用2-ΔΔCT方法进行相对定量分析。

表1 所用引物序列

2 结果

2.1 过表达IbMPK6甘薯株系的建成与筛选

将35S::过表达载体（图1-A）转入

根瘤农杆菌EHA105中浸染甘薯徐薯29的愈伤组织。将浸染后的愈伤在含有潮霉素的MS培养基上进行筛选，最终共获得含有潮霉素抗性的甘薯幼苗株系12株。以pDMC83空载体为阳性对照、非转基因植株（WT）为阴性对照，根据载体上特有的设计引物对这些候选转基因株系进行PCR鉴定。结果显示，12株甘薯株系均能够扩增出与质粒扩增产物大小一致的条带，而WT则不能扩增出条带，说明过表达载体已成功转入甘薯植株（图1-B）。对过表达株系进行转录水平测定，根据相对表达量，筛选出相对表达量最高的株系L3、L8和L11用于下一步试验（图1-C）。

A：IbMPK6过表达载体结构示意图。B：IbMPK6过表达株系PCR鉴定。M：marker；P：质粒；WT：非转基因对照植株，L1—L12：转基因株系。C：qRT-PCR检测筛选IbMPK6过表达株系。不同小写字母表示在P＜0.01水平差异显著。红色边框内表示IbMPK6过表达最高的3个株系L3、L8和L11

2.2 过表达IbMPK6甘薯株系对低温胁迫的耐受性

为确定过表达是否能够提高甘薯耐低温胁迫性，选取生长1个月且长势一致的非转基因对照植株（WT）和转基因株系（L3、L8和L11）进行低温胁迫处理。结果显示，低温胁迫处理2 d后，WT和转基因株系均发生了不同程度的萎蔫，但WT较转基因株系萎蔫程度更加严重。随后移至人工气候室恢复2 d后，转基因株系几乎完全恢复到胁迫处理前的状态，而WT仍然呈现萎蔫状态（图2-A）。

Fv/Fm反应光系统PSⅡ中心最大光能转换效率。低温胁迫后，转基因株系中的Fv/Fm比值下降幅度很小，L3、L8和L11的Fv/Fm分别为0.79、0.79和0.80，而WT的Fv/Fm为0.50，与转基因株系呈现极显著差异水平。温度恢复后，转基因植株中Fv/Fm恢复至低温处理前水平，而WT中Fv/Fm仅为0.70，极显著低于转基因植株。丙二醛是膜脂过氧化的重要产物之一，反映膜系统受损程度。低温胁迫下，WT的丙二醛含量为0.05 μmol·g-1，比低温胁迫处理前上升79.5%。而转基因株系L3、L8和L11中的丙二醛含量分别为0.02、0.04和0.02 μmol·g-1，比低温胁迫处理前分别上升59.2%、74.3%和46.1%，显著低于WT。温度恢复正常后，WT的丙二醛含量为0.03 μmol·g-1，比低温处理前上升57.2%，而转基因株系L3、L8和L11中的丙二醛含量均为0.01 μmol·g-1，比低温胁迫处理前分别上升4.3%、16.6%和3.1%。结果表明，过表达甘薯植株通过减轻光合系统和膜系统的损伤，提高了甘薯对低温胁迫的耐受性。

2.3 低温胁迫下转基因植株活性氧积累的分析

低温通常会引起植物体内活性氧（active oxygen，ROS）的积累，从而引起氧化胁迫[22]。DAB和NBT染色结果显示，低温胁迫下，WT叶片与转基因株系叶片相比，染色较深，说明非转基因对照植株（WT）比转基因植株积累了更多的过氧化氢和超氧阴离子。对过氧化氢含量测定发现低温胁迫下转基因植株中过

氧化氢的含量显著低于WT。温度恢复后，转基因植株和WT的过氧化氢均有所下降，但WT中过氧化氢含量仍高于转基因植株（图3）。结果表明，低温胁迫下过表达能够提高甘薯的抗氧化能力。

2.4 IbMPK6和低温信号转导途径关键基因表达分析

为了研究在低温信号通路中的功能，通过qRT-PCR鉴定了转基因植株和非转基因对照植株（WT）在低温（4℃）处理3 h前后、甘薯低温信号通路重要转录因子和其下游低温调节基因的表达水平（图4）。结果显示，在转基因植株中的表达水平显著高于对照植株，表达量分别比WT上调了7.14、11.15和7.71倍，但在低温胁迫前后表达水平没有明显差异。受低温胁迫诱导表达，低温胁迫后，转基因植株中的表达量远高于对照植株，在L3、L8和L11中的表达量比对照植株分别提高了5.61、7.90和6.87倍。也受低温胁迫诱导表达，低温胁迫后，在L8和L11中的表达量较WT极显著提高，分别比WT上调了2.34和1.96倍。综上所述，低温胁迫下过量表达可以促进低温响应相关基因的表达，提高甘薯植株的耐低温性。

图4 低温胁迫相关基因表达模式分析

Fig.4 Expression pattern of low temperature related genes

3 讨论

甘薯具有良好的适应性，能够充分利用不同地区的光照、温度、水分和土壤条件，可种植在干旱、贫瘠的大量次级耕地和边缘土地上，在促进农业生产及推动区域经济发展中极具潜力[3]。但甘薯不耐低温，当气温降到15℃，甘薯就停止生长，低于9℃，薯块将逐渐受冷害而腐烂；地上部茎叶经霜冻后很快丧失活力而死亡，低温胁迫对甘薯的产量和品质会造成严重损失[23]。选育甘薯耐低温的优良品种，研究甘薯抵御低温胁迫的机制，提高甘薯耐低温性是目前甘薯产业发展过程中亟需解决的关键问题之一。但由于甘薯复杂的遗传背景，甘薯分子生物学和遗传转化等技术起步晚，目前，关于甘薯抵御低温胁迫的机制研究较少。研究者通常采用在甘薯中异源表达与低温胁迫相关基因的方法，提高甘薯的耐低温性。在甘薯中异源表达大豆锌脂蛋白，可以通过提高光合速率和增强氧化还原酶的活性，缓解低温胁迫对甘薯幼苗的伤害[24]。拟南芥酸性核糖体P3B，具有RNA伴侣活性，通过磷酸化和转录后修饰发挥功能，使植株抵御多种非生物胁迫。之前的研究发现甘薯中异源表达该基因，也可提高植株的耐低温性[25]。

植物通过细胞膜对低温信号感知识别，引起质膜流动和钙离子浓度变化，从而激活钙离子通道，或由ROS和ABA等信号途径，经组氨酸激酶、受体激酶、磷酸酯酶和MAPK激酶等信号识别转导，最终通过转录调控应答低温胁迫[26]。MAPK蛋白激酶作为上游信号，通过级联反应将低温信号放大、并传递到下游基因，诱导低温相关基因的表达，提高植物的耐低温性[4]。前人研究中受低温胁迫诱导表达，本研究以过表达甘薯株系响应低温胁迫的研究结果为基础，从生理和分子机制方面解析调控甘薯抵御低温能力。光合作用是低温胁迫时第一个被抑制的代谢过程[27]。低温影响光合器官的结构和活性、叶绿体气孔导度、参与光合作用的酶活性和光合电子传递以及碳同化过程等方面[28]。本研究中，低温胁迫下，过表达植株中Fv/Fm显著高非转基因照植株（WT），说明过表达有效减轻了转基因植株中光合系统受到的损伤。此外，低温胁迫可改变植物的膜相和膜透性，本研究中，低温胁迫和恢复处理下，相比对照植株，过表达植株中丙二醛含量维持在较低的水平，说明转基因甘薯植株能减轻低温胁迫下细胞膜的损伤程度，增强植株的抗氧化能力。过氧化氢和超氧阴离子是活性氧中最重要的成分，植物体内活性氧的过量产生，会破坏离子平衡，损害植物酶系统，引发代谢紊乱，促使有毒物质的积累，破坏植株正常代谢，导致细胞和组织的损伤和死亡[29-30]。本研究中，DAB和NBT染色分析说明过表达提高了低温胁迫下甘薯的抗氧化能力，减轻了活性氧对植株的伤害。

CBF（C-repeat binding factor）是目前低温信号转导途径中研究最为深入的转录因子。CBF蛋白可以通过结合低温调节基因（）的启动子核心区域CRT/DRE，诱导和低温相关基因的表达，提高植株的耐低温性[31]。低温能够诱导强烈表达，很多转录激活因子能够正向调控表达。如ICE1能够结合启动子区MYC元件，调控表达[32]。此外，昼夜节律调节蛋白CCA1[33]、光敏色素作用因子PIF[34]、昼夜节律光受体蛋白ZTL[35]和热激蛋白HSP90[36]也正向调控的表达。JIN等[37]在甘薯中发现并克隆了的同源基因，在拟南芥和甘薯中过表达该基因，会引起表达水平的提高，从而提高植株的耐低温性。本研究中，低温胁迫下，与WT相比，转基因甘薯植株中和的表达量呈显著上升，说明可以介导转录因子CBF的调控途径，提高甘薯的耐低温性。

多数植株中的受低温早期诱导表达，活性氧作为信号调控各种生物学反应，曾被认为是MAPK激酶被环境因素激活的内在原因[38]。过氧化氢可诱导表达，从而活化下游基因，调控植物抵御低温等非生物胁迫[39]。本研究中，随着低温胁迫时间的加长，无论转基因株系还是WT，在低温胁迫3 h后的表达量和胁迫处理前的表达量保持一致，推测可能在蛋白水平上参与调控IbCBF3转录因子调控途径。由于MAPK激酶底物的多样性，目前，有关植物参与调控抵御低温胁迫的机制尚不明确，且在不同作物中低温胁迫下生物学功能也存在差异。在拟南芥中MPK3/MPK6能够抑制ICE1的稳定性，从而降低拟南芥的耐低温性[40]；而在水稻中，OsMPK3/OsMPK6通过磷酸化OsICE1抑制OsICE1的降解，并激活OsICE1下游海藻糖-6-磷酸磷酸酶OsTPP1，参与海藻糖的代谢途径，提高水稻的耐低温性[41]。本研究表明参与调控依赖型信号通路，提高甘薯对低温胁迫的抵御能力，但通过激活哪些底物，并如何激活，是否能够调控非依赖型信号通路等生物学问题还需进一步研究。

4 结论

甘薯参与调控低温响应过程。过表达甘薯植株通过减少低温对光合系统和膜系统的损伤，减少活性氧积累，并调控低温信号转导途径中关键转录因子和下游基因的表达量，提高植株的耐低温性。

[1] CHINNUSAMY V, ZHU J K, SUNKAR R.Gene regulation during cold stress acclimation in plants.Methods in Molecular Biology, 2010: 39-55.

[2] 解则义.贮藏期甘薯响应冷胁迫的miRNA及其靶基因鉴定分析[D].徐州: 江苏师范大学, 2017.

XIE Z Y.Identifies chilling responsive miRNAs and their targets in sweetpotato (Lam.) during storage[D].Xuzhou: Jiangsu Normal University, 2017.( in Chinese)

[3] 马代夫, 李强, 曹清河, 钮福祥, 谢逸萍, 唐君, 李洪民.中国甘薯产业及产业技术的发展与展望.江苏农业学报, 2012, 28(5): 969-973.

MA D F, LI Q, CAO Q H, NIU F X, XIE Y P, TANG J, LI H M.Development and prospect of sweetpotato industry and its technologies in China.Jiangsu Journal of Agricultural Sciences, 2012, 28(5): 969-973.(in Chinese)

[4] SEGER R, KREBS E G.The MAPK signaling cascade.The FASEB journal, 1995, 9(9): 726-735.

[5] MIZOGUCHI T, ICHIMURA K, SHINOZAKI K.Environmental stress response in plants: the role of mitogen-activated protein kinases.Trends in biotechnology, 1997, 15(1): 15-19.

[6] DE Z A, COLCOMBET J, HIRT H.The role of MAPK modules and ABA during abiotic stress signaling.Trends in plant science, 2016, 21(8): 677-685.

[7] FURUYA T, MATSUOKA D, NANMORI T.Membrane rigidification functions upstream of the MEKK1-MKK2-MPK4 cascade during cold acclimation in.FEBS letters, 2014, 588(11): 2025-2030.

[8] XIE G, KATO H, IMAI R.Biochemical identification of the OsMKK6-OsMPK3 signalling pathway for chilling stress tolerance in rice.Biochemical Journal, 2012, 443(1): 95-102.

[9] TEIGE M, SCHEIKL E, EULGEM T, DOCZI F, ICHIMURA K, SHINOZAKI K, DANGL J L, HIRT H.The MKK2 pathway mediates cold and salt stress signaling in.Molecular cell, 2004, 15(1): 141-152.

[10] SHOU H, BORDALLO P, FAN J B, YEAKLEY J M, BIBIKOVA M, SHEEN J, WANG K.Expression of an active tobacco mitogen- activated protein kinase kinase kinase enhances freezing tolerance in transgenic maize.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004, 101(9): 3298-3303.

[11] KOVTUN Y, CHIU W L, TENA G, SHEEN J.Functional analysis of oxidative stress-activated mitogen-activated protein kinase cascade in plants.Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America, 2000, 97(6): 2940-2945.

[12] KONG X P, PAN J W, ZHANG M Y, XING X, ZHOU Y, LIU Y, LI D P, LI D Q.ZmMKK4, a novel group C mitogen-activated protein kinase kinase in maize (), confers salt and cold tolerance in transgenic.Plant, cell & environment, 2011, 34(8): 1291-1303.

[13] YU L, YAN J, YANG Y, ZHU W M.Overexpression of tomato mitogen-activated protein kinase SlMPK3 in tobacco increases tolerance to low temperature stress.Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2015, 121(1): 21-34.

[14] PAN J, ZHANG M, KONG X, XING X, LIU Y K, ZHOU Y, LIU Y, SUN L P, LI D Q.ZmMPK17, a novel maize group D MAP kinase gene, is involved in multiple stress responses.Planta, 2012, 235(4): 661-676.

[15] ROBINSON M J, COBB M H.Mitogen-activated protein kinase pathway.Current Opinion Cell Biology, 1997, 9(2): 180-186.

[16] DROILLARD M, BOUDSOCQ M, BARBIER-BRYGOO H, LAURIERE, C.Different protein kinase families are activated by osmotic stresses incell suspensions: involvement of the MAP kinase AtMPK3 and AtMPK6.FEBS Letters, 2002, 527: 43-50.

[17] LIU Y, ZHANG D, WANG L, LI D Q.Genome-wide analysis of mitogen-activated protein kinase gene family in maize.Plant molecular biology reporter, 2013, 31(6): 1446-1460.

[18] XIE G, KATO H, SASAKI K, IMAI R.A cold-induced thioredoxin h of rice, OsTrx23, negatively regulates kinase activities of OsMPK3 and OsMPK6.FEBS letters, 2009, 583(17): 2734-2738.

[19] KIM H S, PARK S C, JI C Y, PARK S, JEONG J C, LEE H S, KWAK S S.Molecular characterization of biotic and abiotic stress-responsive MAP kinase genes, IbMPK3 and IbMPK6, in sweetpotato.Plant Physiology & Biochemistry, 2016, 108: 37-48.

[20] HODGES D M, DELONG J M, PRANGE F.Improving the thiobarbituric acid-reactive-substances assay for estimating lipid peroxidation in plant tissues containing anthocyanin and other interfering compounds.Planta, 1999, 207(4): 604-611.

[21] ZHOU B, WANG J, GUO Z, TAN H Q, ZHU X C.A simple colorimetric method for determination of hydrogen peroxide in plant tissues.Plant Growth Regulation, 2006, 49(2/3): 113-118.

[22] BAXTER A, MITTLER R, SUZUKI N.ROS as key players in plant stress signalling.Journal of Experimental Botany, 2014, 65(5): 1229-1240.

[23] 江苏省农业科学院.中国甘薯栽培学.第12版.上海: 上海科学技术出版社, 1984.

Jiangsu Academy of Agricultural Sciences.Sweetpotato cultivation in China.12th ed.Shanghai: Shanghai Science and Technology Press, 1984.(in Chinese)

[24] KIM Y H, KIM M D, PARK S C, YANG K S, JEONG J C, LEE H S, KWAK S S.SCOF-1-expressing transgenic sweetpotato plants show enhanced tolerance to low-temperature stress.Plant Physiology Biochemistry, 2011, 49(12): 1436-1441.

[25] JI C Y, JIN R, XU Z, KIM H S, LEE C J, KANG L, KIM S E, LEE H U, LEE J S, KANG C H, CHI Y H, LEE S Y, XIE Y P, LI H M, MA D F, KWAK S S.Overexpression ofP3B increases heat and low temperature stress tolerance in transgenic sweetpotato.BMC Plant Biology, 2017, 17: 139.

[26] GONG Z Z, XIONG L M, SHI H Z, YANG S H, HERRERA- ESTRELLA L R, XU G H, CHAO D Y, LI J R, WANG P Y, QIN F, LI J J, DING Y L, SHI Y T, WANG Y, TANG Y Q, GUO Y, ZHU J K.Plant abiotic stress response and nutrient use efficiency.Science China-Life sciences, 2020, 63(5): 635-674.

[27] HU W H, WU Y, ZENG J Z, HE L, ZENG Q M.Chill-induced inhibition of photosynthesis was alleviated by 24-epibrassinolide pretreatment in cucumber during chilling and subsequent recovery.Photosynthetica, 2010, 48(4): 537-544.

[28] THEOCHARIS A, CLÉMENT C, BARKA E A.Physiological and molecular changes in plants grown at low temperatures.Planta, 2012, 35(6): 1091-1105.

[29] BANTI V, MAFESSONI F, LORETI E, ALPI A, PERATA P.The heat-inducible transcription factor HsfA2 enhances anoxia tolerance in.Plant Physiology, 2010, 152(3): 1471-1483.

[30] VOLKOV R A, PANCHUK I I, MULLINEAUX P M, SCHÖFFL F.Heat stress-induced H2O2is required for effective expression of heat shock genes in.Plant Molecular Biology, 2006, 61(4/5): 733-746.

[31] SHI Y T, DING Y L, YANG S H.Cold signal transduction and its interplay with phytohormones during cold acclimation.Plant Cell Physiology, 2015, 56(1): 7-15.

[32] CHINNUSAMY V, OHTA M, KANRAR S, LEE B H, HONG X, AGARWAL M, ZHU J K.ICE1: a regulator of cold-induced transcriptome and freezing tolerance in.Genes Development, 2003, 17(8): 1043-1054.

[33] DONG M A, FARRÉ E M, THOMASHOW M F.Circadian clock associated 1 and late elongated hypocotyl regulate expression of the C-repeat binding factor (CBF) pathway in.Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America, 2011, 108(17): 7241-7246.

[34] JIANG B C, SHI Y T, ZHANG X Y, XIN X Y, QI L J, GUO H W, LI J W, YANG S H.PIF3 is a negative regulator of the CBF pathway and freezing tolerance in.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2017, 114(32): E6695-E6702.

[35] KIM W Y, FUJIWARA S, SUH S S, KIM J, KIM Y, HAN L, DAVID K, PUTTERILL J, NAM H G, SOMERS D E.ZEITLUPE is a circadian photoreceptor stabilized by GIGANTEA in blue light.Nature, 2007, 449(7160): 356-360.

[36] NORÉN L, KINDGREN P, STACHULA P, RÜHL M, ERIKSSON M E, HURRY V, STRAND Å.HSP90, ZTL, PRR5 and HY5 integrate circadian and plastid signaling pathways to regulate CBF and COR expression.Plant Physiology, 2016, 171: 1392-1406.

[37] JIN R, KIM B H, JI C Y, KIM H S, MA D F, KWAK S S.Overexpressing IbCBF3 increases low temperature and drought stress tolerance in transgenic sweetpotato.Plant Physiology and Biochemistry, 2017, 118: 45-54.

[38] PITZSCHKE A, HIRT H.Mitogen-activated protein kinase and reactive oxygen species signaling in plants.Plant Physiology, 2006, 141(2): 351-356.

[39] NISHIHAMA R, BANNO H, KAWAHARA E, IRIE K, MACHIDA Y.Possible involvement of differential splicing in regulation of the activity ofANP1 that is related to mitogen-activated protein kinase kinase kinases (MAPKKKs).The Plant Journal, 1997, 12(1): 39-48.

[40] LI H, DING Y L, SHI Y T, ZHANG X Y, ZHANG S Q, GONG Z Z, YANG S H.MPK3-and MPK6-mediated ICE1 phosphorylation negatively regulates ICE1 stability and freezing tolerance in.Developmental Cell, 2017, 43(5): 630-642.

[41] ZHANG Z Y, LI J H, LI F, LIU H H, YANG W, CHONG K, XU Y Y.OsMAPK3 phosphorylates OsbHLH002/OsICE1 and inhibits its ubiquitination to activate OsTPP1 and enhances rice chilling tolerance.Developmental cell, 2017, 43(6): 731-743.

, amitogen-activated protein kinase, confers low temperature tolerance in sweetpotato

JIN Rong, LIU Ming, ZHAO Peng, ZHANG QiangQiang, ZHANG AiJun, TANG ZhongHou*

Xuzhou Institute of Agricultural Sciences of Xuhuai District of Jiangsu Province/Xuzhou Sweetpotato Research Center of Jiangsu Province/Key Laboratory of Sweetpotato Biology and Genetic Breeding, Ministry of Agriculture, Xuzhou 221131, Jiangsu

【Objective】Studying the function of mitogen activated protein kinase (MAPK)【Method】strain EHA105 harbored the plasmid 35S::were transformed intosweetpotato cv.Xushu29 embryogenic callus.Molecular examination and qRT-PCR were used to screen and select transgenic lines.For low temperature stress assay, selected transgenic lines were performed to observe the phenotype and determine the physiological indexes such as Fv/Fm, the content of malondialdehyde (MDA) and hydrogen peroxide (H2O2) after low temperature treatment and recovery treatment.Diaminobenzidine (DAB) staining and nitro blue tetrazolium (NBT) staining analysis were performed to observe reactive oxygen species (ROS) accumulation.The expression level of the key transcription factorand downstream geneinvolved in low temperature signal transduction pathway were identified before and after low temperature treatment.【Result】Twelve transgenic lines were generated and three transgenic lines (L3, L8 and L11) with a high expression level ofwere selected for low temperature tolerance assay.Under low temperature stress, the level of Fv/Fm in transgenic lines L3, L8 and L11 was 0.79, 0.79 and 0.80, while that in WT was 0.05.After temperature recovery treatment, Fv/Fm in transgenic lines has recovered to former levels, whereas the level of Fv/Fm in WT was only 0.70, which was significantly lower than that in transgenic lines.MDA content of three transgenic (lines L3, L8 and L11) increased by 0.02, 0.04 and 0.02 μmol·g-1, and it of WT increased by 0.05 μmol·g-1after low temperature stress treatment, respectively.After recovery treatment, MDA content in transgenic lines was 0.01 μmol·g-1on average, whereas it of WT was 0.03 μmol·g-1.The results of DAB and NBT staining showed that the leaves of WT were stained deeper than those of transgenic lines, indicated that hydrogen peroxide and superoxide anion were accumulation less in transgenic lines than in WT.Furthermore, H2O2level in WT was significantly higher than that in transgenic lines under low temperature stress condition and after recovery treatment.Low temperature regulated the expression level ofandgenes, but the expression level in transgenic lines was higher than that in WT.【Conclusion】Overexpression ofinvolved in low temperature signaling transduction pathway by up-regulating the expression level of cold related genesand.

sweetpotato;; transgenic lines; low temperature stress

2021-04-06；

2021-06-21

国家自然科学基金青年科学基金（31801447）、上海市资源植物功能基因组学重点实验室开放课题（PFGR201905）、农业农村部薯类作物生物学与遗传育种综合性重点实验室开放课题（NYBSL201802）

靳容，E-mail：jinrong_2012@126.com。通信作者唐忠厚，E-mail：zhonghoutang@sina.com

（责任编辑 李莉）