多肉植物红宝石组织培养快繁技术

陈伟 曾凡 赵光辉

摘 要：为建立多肉植物红宝石高效组织培养快繁技术体系，为工厂化生产提供技术保障。以多肉植物红宝石的幼嫩叶片作为外植体，进行多肉植物红宝石组培快繁技术研究。结果表明：采用75%酒精浸泡60 s，再使用0.1%升汞处理10 min是红宝石外植體最佳消毒处理方法。红宝石愈伤组织诱导的最适培养基为MS+6-BA 1.5 mg·L1+NAA 0.5 mg·L1（pH=6.0），诱导率可达83.3%;愈伤组织分化成芽的最适培养基为MS+6-BA 0.6 mg·L1+NAA 0.2 mg·L1（pH=6.0），分化率可达77.78%;生根最适培养基为1/2 MS+活性炭2.0 g·L1（pH=6.0），生根率可达70.00%。

关键词：多肉植物;红宝石;组织培养;快繁技术

中图分类号：S 682.33   文献标志码：A   文章编号：0253-2301（2021）08-0033-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.08.005

Rapid Propagation of Sedeveria Pink Ruby by Tissue Culture

CHEN Wei， ZENG Fan， ZHAO Guang-hui

（Fuzhou Institute of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350018， China）

Abstract： In order to establish the rapid propagation technology system of Sedeveria pink ruby by high-efficient tissue culture， and provide the technical support for industrialized production， the tissue culture and rapid propagation technology of Sedeveria pink ruby was studied by using the young leaves of Sedeveria pink ruby as the explants. The results showed that 75% alcohol soaked for 60 s and 0.1% mercury bichloride treated for 10 min were the best disinfection treatments for the explants of Sedeveria pink ruby. The optimal culture medium for callus induction of Sedeveria pink ruby was MS+1.5 mg·L1 6-BA+0.5 mg·L1 NAA （pH=6.0）， with the induction rate of 83.3%. The optimum culture medium for bud differentiation from callus was MS+0.6 mg·L1 6

-BA+0.2 mg·L1 NAA （pH=6.0）， with the differentiation rate of 77.78%. The optimal culture medium for rooting was 1/2 MS+2.0 g·L1 activated carbon （pH=6.0）， and the rooting rate could reach 70.00%.

Key words： Succulents; Sedeveria pink ruby; Tissue culture; Rapid propagation technology

多肉植物红宝石Sedeveria pink ruby为景天科拟石莲花属植物，是近几年发展较快的一种多肉植物[1]。红宝石是中小型多肉品种，非常容易群生，长成爆盆品种;其叶片较多，光滑，细长匙状，前端较肥厚、斜尖，呈莲花状紧密排列，整体较包裹，植株紧凑，单株直径5 cm左右。红宝石正常生长时颜色为绿色，如温差大、光照充足，其颜色会从绿色变成火红色，色泽如宝石，加上其容易群生，长成捧花状态，具有较高的观赏价值。但红宝石生产主要以叶插繁殖为主，因其繁殖速度慢、生产周期长、加上病毒不断积累，品质受到较大的影响。

植物组织培养是利用植物细胞能够发育成完整植株的功能进行的无性繁殖方法，组织培养能保持原有品种固有的性状和特性，可以用来解决制约多肉植物产业快速发展的繁殖问题[2-6]。目前已有景天属景天科大和锦、劳尔、石台景天、大花红景天、青锁龙、八宝景天、黄丽等多肉植物组织培养的研究[7-13]，但是利用红宝石叶片作为外植体进行组织培养研究未见报道。因此，开展红宝石组织培养技术研究在生产显得尤为重要。本研究通过对多肉植物红宝石组织培养过程中的外植体消毒方式、培养基激素配比进行研究，筛选红宝石丛生芽诱导、增殖、生根繁殖等关键环节的最适培养条件，探索多肉植物红宝石组织培养快繁技术体系，以期为多肉植物红宝石的工厂化生产提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验以多肉植物红宝石幼嫩叶片为外植体，材料来源于福州市农业科学研究所多肉种植示范大棚。夏季红宝石为休眠期不适取材，此季节的多肉植物外植体在培养基中对激素常反应迟钝，生长静止，不易培养成功。

1.2 试验药剂及仪器

MS培养基母液、盐酸、氢氧化钠、蔗糖、琼脂粉（凝胶强度>1300 g·cm2）、6-糠基氨基嘌呤（KT）、萘乙酸（NAA）、6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）、吲哚-3-乙酸（IAA）、75%酒精、升汞溶液0.1%。1 mL移液枪、5mL移液枪、解剖刀、镊子、酒精灯、滤纸、滤纸盒、国之源P20-y超纯水、培养瓶、陶瓷杯、YXQ-LS-74SII高压灭菌锅、无菌工作台、1 L容量瓶、100 mL容量瓶、计时器。

1.3 试验方法

1.3.1 材料预处理 将红宝石叶片以自来水冲洗干净，用纱布将叶片包住，蒸馏水冲洗10 min，调整位置保证冲洗均匀。冲洗完后，取适量的表面洗涤剂（洗衣粉或洗洁精）放入 1000 mL 烧杯中，加蒸馏水用玻璃棒搅拌混匀，混匀后将纱布中的叶片轻放入烧杯。玻璃棒搅拌后，静置10 min 充分去污。 取出红宝石叶片，用纱布清洗叶片表面，清洗的过程中一定要全面，细细轻柔搓洗，洗净之后再用蒸馏水冲洗叶片10 min。

1.3.2 无菌室及超净台灭菌 先对无菌室进行灭菌，然后用酒精棉球擦拭超净台，打开超净台紫外线灯杀菌消毒20 min，打开排气扇，防止细菌进入，保持一个无菌的环境。

1.3.3 培养条件 在MS基本培养基上添加8 g·L1的琼脂和30 g·L1的蔗糖，pH 值调节至 5.8～6.0，当压力达1.1 kg·cm

-2，121℃高压灭菌锅中灭菌20 min，常温后添加激素（激素已抽滤灭菌）备用。培养室温度控制在25℃，光照强度2000 lx，光周期为12 h·d1的培养室中培养。

1.3.4 外植体的消毒 外植体的消毒方法选择先用75%酒精浸泡，再用0.1%升汞浸泡处理，处理时间分别为3、5、10 min。将处理好的红宝石叶片在自来水下冲洗干净之后放入超净工作台内，先用75%酒精浸泡60 s，要轻微振荡，切勿摇出;再用0.1%升汞分别浸泡处理3、5、10 min，而后用无菌水冲洗6遍，每遍10 s左右 ，冲洗之后用消毒滤纸吸干水分。将清洗消毒后的红宝石叶片，横切成0.3 cm左右的方块，分别接种于预先灭菌的MS培养基中培养。每个处理接种30个外植体。30 d后观察其生长情况，并统计污染率。计算公式：污染率=污染数/30×100%。

1.3.5 诱导培养 以MS为基本培养基，设置不同浓度和配比的细胞分裂素6-BA、KT和生长素NAA，以红宝石叶片作为外植体接种到6种不同的诱导培养基中，处理1：MS+6-BA 2.0 mg·L1+NAA 0.5 mg·L1;处理2：MS+6-BA 2.0 mg·L1+NAA 1.0 mg·L1;处理3：MS+6-BA 1.5 mg·L1+NAA 0.5  mg·L1;处理4：MS+6-BA 1.5 mg·L1+NAA 1.0 mg·L1;处理5：MS+6-BA 1.0 mg·L1+NAA 0.5 mg·L1+KT 0.5 mg·L1;處理6：MS+6-BA 1.0 mg·L1+NAA 2.0 mg·L1;每个处理接种6瓶，每瓶接种4个外植体，3次生物学重复，30～40 d统计诱导情况。计算公式：诱导率=形成愈伤组织或分化生根或成芽的个数/总接种数×100%。

1.3.6 分化培养 在超净工作台上将初代培养中诱导得到的40 d的愈伤组织接种于6种附加不同含量 6-BA、NAA、KT、IAA的分化培养基中，处理1：MS+KT 2.0 mg·L1+ IAA 2.0 mg·L1; 处理2：MS+KT 2.0 mg·L1+IAA 4.0 mg·L1;处理3：MS+ 6-BA 3.0 mg·L1+NAA 0.2 mg·L1;处理4：MS+6-BA 1.0 mg·L1+NAA 0.2 mg·L1; 处理5：1/2MS+6-BA 0.6 mg·L1+NAA 0.2 mg·L1;处理6：MS+6-BA 0.6 mg·L1+NAA 0.2 mg·L1;每组6瓶，每瓶接种4块愈伤组织或丛生芽。分别于分化培养25、40 d后统计分化培养情况，并计算分化率，计算公式为：分化率=已分化的外植体数/外植体总数×100%。

1.3.7 增殖培养 将初代培养中诱导得到的长势良好的丛生芽或愈伤组织转接至激素浓度为MS+L 6-BA 1.5 mg·L1+NAA 0.5 mg·L1的培养基中进行继代增殖培养，总共接种30 瓶，每瓶接种4块丛生芽，分别于增殖培养30 d和40 d后统计增殖情况。计算公式：增殖系数=出芽数/原有芽数。

1.3.8 生根培养 在无菌条件下，将增殖后的丛生芽分离出单芽，接种于生根培养基上进行生根培养，生根培养基以1/2 MS为基本培养基，在此基础上添加不同浓度的 NAA，同时添加2.0 g·L1活性炭。生根培养基设处理1：1/2MS+活性炭2.0 g·L1;处理2：1/2MS+NAA 0.2 mg·L1+活性炭2.0 g·L1 ;处理3：1/2MS+NAA 0.03 mg·L1+活性炭2.0 g·L1。分别于生根培养30 d和40 d后统计组培苗的成长情况。

1.3.9 炼苗与移栽 小苗根长1 cm 时可以出苗，将培养瓶移出培养室，置于常温室中自然散射光培养1周后，打开瓶盖，炼苗2～3 d，镊子取出瓶苗，用自来水洗净根系附着的培养基，自然晾干水分后，种植于专门的基质中。以泥炭、蛭石、珍珠岩复配材料为炼苗基质，按照3∶1∶1 比例混匀。稍遮阴，并注意通风，栽下后第1次不浇水。1个星期后喷1000倍多菌灵杀菌剂，浇少量水。

2 结果与分析

2.1 外植体灭菌条件筛选

从红宝石外植体采用不同消毒方式的污染情况（表1）可知，红宝石外植体先采用75%酒精浸泡60 s，再用0.1%升汞浸泡处理10 min消毒的效果最佳，其污染率最低，仅为6.67%。

2.2 不同激素配比对红宝石愈伤组织诱导的影响

不同激素配比的培养基均能成功诱导红宝石形成愈伤组织，都有一定的诱导效果;诱导率最高可达83.3%，最低为25.5%（表2）。处理1、2、4、5、6中所有外植体均出现膨大、形成少量愈伤组织，但颜色不深，具有一定的诱导效果;在处理3中外植体均膨大、形成大量蓬松且颜色较深的愈伤组织，诱导作用较为明显，愈伤组织结构紧密（图1）。适宜诱导红宝石形成愈伤组织培养基为MS+6-BA 1.5 mg·L1+NAA 0.5 mg·L1。

2.3 不同激素配比对红宝石愈伤组织分化的影响

从添加不同激素配比培养基对红宝石愈伤组织分化的影响结果（表3）可知，MS+6-BA 0.6 mg·L1+NAA 0.2 mg·L1或1/2 MS+6-BA 0.6 mg·L1+NAA

0.2 mg·L1培养基中均可促进红宝石愈伤组织分化。其中，红宝石在MS+6-BA 0.6 mg·L1+NAA 0.2 mg·L1的分化效果最好，25、40 d的分化率可达66.67%和77.78%。未添加6-BA或添加6-BA浓度超过1.0 mg·L1的培养基均不利于红宝石愈伤组织分化，大部分愈伤组织分化培养之后褐化死亡。只有当6-BA浓度在0.6 mg·L1时愈伤组织结构紧密，呈淡黄绿色，丛生芽数量多，整齐度高（图2）。研究结果表明适宜诱导红宝石丛生芽的培养基为MS+6-BA 0.6 mg·L1+NAA 0.2 mg·L1。

2.4 红宝石愈伤组织增殖培养

将培养30 d，且长势良好的愈伤组织或丛生芽转接至MS培养基+6-BA 1.5 mg·L1+NAA 0.5 mg·L1中进行继代增殖培养，30 d后不定芽生长迅速，填充整个培养瓶（图3）。大部分丛生芽的基部均可连续分化出几个单芽，经过40 d之后，可呈现出团簇状丛生，丛生芽逐渐变为深绿色。接种数为120个，增殖数517个，增殖系数为4.31。

图3 红宝石丛生芽继代培养30 d生长情况

Fig.3 Growth of the cluster buds of Sedeveria pink ruby after the subculture for 30 days

2.5 不同培養基配比对红宝石丛生芽生根的影响

从表4可知，处理1培养基中的芽生根率最高，30 d生根率为50%，40 d为70%，且生根粗壮，长度达1 cm（图4）。结果表明：1/2MS+活性炭 2.0g·L1 的培养条件最为适宜，生根数量最多，效果好。

2.6 移栽

小苗根长1 cm 时可以出苗，取出瓶苗，用自来水洗净根系附着的培养基，自然晾干水分后，种植于专门的基质中，稍遮阴，并注意通风。第1次不浇水。1个星期后喷杀菌剂，浇少量水。小苗移栽成活率可达78%。

3 讨论与结论

多肉植物叶插繁殖速度慢，而利用组培快繁技术能够快速获得大量组培苗。由于多肉植物肉质多汁，其外植体需消毒彻底，否则污染率较高。研究表明，多肉植物在组织培养过程中外植体消毒时间太长会出现叶片透明、白化现象，而消毒时间太短则外植体易受污染[14-15]。本试验结果表明先用75%酒精浸泡60 s，再用0.1%升汞处理10 min，是红宝石外植体的最佳消毒方式，能获得较低污染率的红宝石无菌叶片。

植物生长调节剂是影响组织培养器官分化的关键因素[16]，培养基中不同生长调节剂的相对浓度决定形成器官的类型。在含有细胞分裂素（如6-BA）的培养基中添加一定浓度的生长素（如NAA）能促进不定芽的形成。植株组培中影响生根的因素，主要是培养基成分和激素成分与比例[17-18]。因此，探索最适激素浓度配比对红宝石多肉植物快速繁殖具有重要意义。本研究通过对红宝石各阶段培养基配方进行对比试验，确定红宝石愈伤组织诱导、分化、生根阶段的最佳培养基配方，试验结果表明红宝石叶片愈伤组织诱导的最适培养基为MS+3%蔗糖+0.8%琼脂粉+6-BA 1.5 mg·L1+ NAA 0.5 mg·L1（pH=6.0），诱导率为83.3%;愈伤组织分化成芽的最适培养基为MS+3%蔗糖+0.8%琼脂粉+6-BA 0.6 mg·L1+NAA 0.2 mg·L1（pH=6.0），分化率为77.78%;生根的最适培养基为1/2 MS+3%蔗糖+0.8%琼脂粉+2.0 g·L1活性炭（pH=6.0），生根率为70.00%。本研究以多肉植体红宝石叶片为外植体，筛选获得了红宝石叶片外植体的最佳消毒方式以及组织培养各阶段的最佳培养基配方，初步建立红宝石多肉植物组培快繁技术体系，研究结果可多肉植物红宝石的工厂化育苗提供参考依据。

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（责任编辑：林玲娜）

收稿日期：2021-03-24

作者简介：陈伟，男，1968年生，副研究员，主要从事多肉植物研究。

基金项目：福州市科技计划项目（2019-N-8）。