豚草粗提物提取及对杨树烂皮病抑菌效果比较

纪纯阳

(辽宁省杨树研究所，辽宁 盖州 115213)

豚草Ambrosiaartemisiifolia又名艾叶破布草，属菊科、豚草属，1年生草本植物。它被列为世界公认的危害性杂草，在我国各地均有分布[1]。许多学者对豚草进行了各方面研究，主要包括形态学、分类学、生理生态学、种群生态学等[2]。其含有丰富的倍半萜内酯类化合物，具有化感、杀虫抑菌、灭螺等多种生物活性[3-4]。

杨树烂皮病又称腐烂病，病原有性阶段为污黑腐皮壳菌Valsasordida，无性阶段为金黄壳囊孢菌Cytosporachrysosperma[5]。杨树烂皮病是危害严重的枝干病害，是潜伏侵染性病害，通常分为干腐型和枝枯型。当遇到冻害、水涝、干旱及日灼等恶劣环境，或者受移植苗木或修剪强度大等因素影响时，树木不易恢复生机而导致病害迅速发生，轻度会影响到树木生长，出现枯枝、枯干、放叶晚、叶片变小等病状，严重时造成树木大面积死亡[5-6]。杨树病害的防治常采用化学农药，而传统的化学农药存在污染环境和产生抗药性等问题，人们越来越倾向于从天然物质中寻找更安全、更高效的活性物质以开发新型农药。从植物中寻找抑菌活性物质是开发、研制无公害新型抑菌剂的重要途径之一[7]。

豚草作为一种新型植物源农药的植物资源，在农林渔业有一定的应用，但如何从豚草的叶片中提取抑菌活性物质是应用的前提条件。本文研究了豚草粗提物的提取工艺及对杨树烂皮病林间防治效果比较，这在省内未见报道，以期为新型植物源农药的研究提供前期的基础，为推进植物源农药在林木病虫害防治中的应用与推广提供依据。

1 供试材料

1.1 试验材料

豚草Ambrosiaartemisiifolia，采自辽宁省盖州市高丽城和西海等地区。

试验地设在国有新民机械化林场，4年生108杨栽植密度2.5 m×5 m，自然发生杨树烂皮病。

1.2 供试药剂

50%多菌灵(江苏蓝丰生物化工股份有限公司)，3%甲基硫菌灵(山西北方果康宝农药有限公司)，果缘高(山西省农科院棉花所三联农化实验厂)。

2 试验方法

2.1 豚草叶片的预处理

将采集的豚草叶片用清水洗净，放于通风阴凉处阴干，再用50 ℃烘箱烘干至恒重后，用中药材粉碎机粉碎1 min，称重分装于棕色试剂瓶中，放于阴凉处保存备用[8-9]。

2.2 豚草粗提物提取方法

选取了冷浸、温浸、索氏、超声波、冷浸-超声波联合和温浸-超声波联合6种提取方法提取豚草粗提物[10-15]。

2.2.1 冷浸法

称取豚草粉末10 g装入250 mL烧杯内，加入80%乙醇溶液200 mL，用保鲜膜将烧杯口密封，室温浸泡24 h，并搅拌3～4次。

2.2.2 温浸法

称取豚草粉末10 g装入250 mL的烧杯内，加入80%乙醇溶液200 mL，用保鲜膜将烧杯口密封好，放在恒温水浴锅(40 ℃)24 h，并搅拌3～4次。

2.2.3 索氏提取法

称取豚草粉末10 g，用滤纸包成封闭小包，务必封好口不让粉末漏出，将小包置于索氏提取器中，加入80%乙醇200 mL，90 ℃水浴加热约10 h，让小纸包完全浸透，发生虹吸现象后，停止提取。

2.2.4 超声波提取法

称取豚草粉末10 g装入250 mL锥形瓶中，加入80%的乙醇溶液200 mL，用保鲜膜和橡皮筋密封，置于超声波振荡50 min，并搅拌2次。

2.2.5 冷浸-超声联合提取法

称取豚草粉末10 g装入250 mL锥形瓶中，加入80%乙醇溶液200 mL，用保鲜膜和橡皮筋密封，室温放置2 h后超声波振荡50 min，再室温放置22 h，并搅拌3～4次。

2.2.6 温浸-超声联合提取法

称取豚草粉末10 g置于250 mL锥形瓶中，加入80%乙醇200 mL，用保鲜膜和橡皮筋密封，40 ℃水浴2 h后超声波振荡50 min，之后再水浴22 h，并搅拌3～4次。

2.2.7 提取物的析出

以上6种提取方法设置3次重复，各组提取液经真空抽滤后用旋转蒸发器(40 ℃，80～120 r·min-1)减压浓缩至无溶剂滴出，即得膏状粗提物，再将其转移至小烧杯或平皿中，必要时可使用10%的吐温溶液助溶，于40 ℃烘箱中烘干称重，放入4 ℃冰箱中保存[16]。计算提取率，确定最佳的提取方法。

2.3 豚草粗提物提取条件的优化

对最佳提取方法中的提取条件因子进行优化，选择4因素3水平进行正交试验设计(表1)，设置3次重复。各组提取液经真空抽滤后用旋转蒸发器(40 ℃，80～120 r·min-1)减压浓缩至无溶剂滴出，即得膏状粗提物，再将其转移至小烧杯或平皿中，必要时可使用10%的吐温溶液助溶，于40 ℃烘箱中烘干称重，计算提取率，确定最优的提取条件[17-19]。

表1 正交试验因素和水平

2.4 豚草粗提物对杨树烂皮病的林间防治试验

辽宁省新民市国有机械化林场4年生108杨，自然发生杨树烂皮病。共选择4种药剂，豚草提取物(40 mg·mL-1)、果缘高(原液)、多菌灵(500倍稀释液)、甲基硫菌灵(5倍稀释液)，对4年生108杨杨树烂皮病进行了林间防治试验。因病斑面积大，采用刮皮后涂抹和直接涂抹2种方法进行防治，选取3个连续区域(3次重复)，隔7 d再涂抹1次，40 d后进行病害调查。根据烂皮病病斑是否外扩统计病害防治情况[20-21]。

2.5 统计方法

采用DPS18.10高级版软件LSD法进行数据分析，计算粗提物提取率和林间防治病株减退率[22-23]。公式如下：

3 结果与分析

3.1 豚草粗提物提取方法

选取冷浸、温浸、索氏、超声波、冷浸-超声波联合及温浸-超声波联合6种提取方法提取豚草中抑菌活性物质，以提取物干重为测量指标，计算提取率。6种提取方法提取率依次为：温浸-超声波法(18.93%)>冷浸-超声波法(17.14%)>超声波法(16.99%)>索氏法(16.93%)>温浸法(15.25%)>冷浸法(14.10%)，温浸-超声波法除了与冷浸-超声波法差异不显著外，与其它4种提取方法存在显著性差异(P<0.05)。因此豚草粗提物最佳提取方法为温浸-超声联合提取法，提取率达到18.93%。

3.2 豚草提取物提取条件的优化

选择温浸-超声波联合法提取豚草粗提物，对提取过程中影响显著的4个因素各选3个水平进行正交试验，结果见表2。

表2 豚草粗提物提取条件正交试验结果

通过正交试验确定最佳的提取条件为第5组A2B2C3D1组合，即超声波时间45 min、乙醇体积分数75%、料液比1∶20 g·mL-1、40 ℃水浴24 h。其中超声波时间和乙醇体积分数两个因素对豚草粗提物的提取率影响显著。在最佳提取工艺下，豚草粗提物的提取率达到20.35%。

3.3 豚草粗提物与3种药剂对杨树烂皮病的林间防治效果

从表3可以看出，刮皮后涂药处理的病株减退率依次是豚草粗提物>多菌灵>果缘高>甲基硫菌灵，直接涂抹病株减退率依次是多菌灵>豚草粗提物>甲基硫菌灵>果缘高，由此可见刮皮后涂药处理比直接涂抹防治效果更佳，豚草粗提物与多菌灵的防治效果优于其他2种药剂，说明豚草粗提物对杨树烂皮病有较好的防治作用。

表3 四种药剂对杨树烂皮病的林间防治试验效果比较

4 结论与讨论

本文对豚草粗提物的提取工艺进行优化，通过试验确定了最佳的提取方法为温浸-超声波联合提取法，提取条件为超声波45 min、75%乙醇溶液、料液比1∶20 g·mL-1、40 ℃水浴24 h，提取率为20.35%。

为了更好地将豚草提取物质应用于林业病害的防治中，开展了豚草粗提物与3种药剂对杨树烂皮病的林间防治效果比较试验。采用刮皮后涂抹防治效果更佳，豚草粗提物与多菌灵的防治效果优于其他2种药剂，证实豚草粗提物对杨树烂皮病有较好的防治作用。本项研究在豚草粗提物林间防治杨树烂皮病方面虽然达到了一定的效果，但林间防治还存在防治药剂的选择、防治时间、药剂使用量和防治效果统计分析难度大等问题，本试验仅开展了小样本的林间防治，在确定试验效果后可再开展大规模的防治试验。

本研究为进一步开发林业用植物源杀菌剂提供理论依据，为确定用于生产和防治工作的新型植物源农药提供前期研究基础，使豚草这种入侵植物变废为宝，对推进无公害农药的研究和应用有着重大的意义。