HPLC法测定参柏湿疹搽剂中四种成分的含量

曾 金，李 萍，欧人豪，肖 萍

(柳州市妇幼保健院，广西科技大学附属妇产医院/儿童医院，广西 柳州 545001)

参柏湿疹搽剂是柳州市妇幼保健院皮肤科用于治疗皮肤湿疹的经验方(以儿童患者为主)，由苦参、黄柏、地榆、紫草、马齿苋、雷公藤、丹参七味中药组成，组合新颖，疗效明确可靠，具有清热燥湿止痒、凉血活血透疹的功效[1]。本研究拟通过制定方中苦参碱和氧化苦参碱、黄柏碱和小檗碱的高效液相含量测定法，来达到控制药物质量的目的。

1 材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪(岛津香港有限公司)；电子分析天秤(型号FA1004，上海天平仪器厂)；数显恒温水浴锅(型号HH-6，江苏金坛市环宇科学仪器厂)；数控超声波清洗器(型号KQ-300DB，昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试剂

对照品均为南京源植生物科技有限公司生产：黄柏碱对照品(批号yz180414)、小檗碱对照品(批号yz180103)、苦参碱对照品(批号yz170331)、氧化苦参碱对照品(批号yz170614)；参柏湿疹搽剂样品(每瓶500ml)由柳州市妇幼保健院药剂科制剂室提供(批号：20200423，20200522，20200624 )；乙腈(天津市科密欧化学试剂有限公司 20200221)、甲醇(天津市四友精细化学品有限公司 633379)为色谱纯；其他试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 苦参碱和氧化苦参碱含量测定

2.1.1 溶液的制备 ①供试品溶液：精密量取湿疹方样品5 mL，置于分液漏斗中，加入浓氨试液1 mL，充分振摇后，静置30 min，用30 mL氯仿分3次萃取，每次10 mL，收集氯仿层，置于蒸发皿中，水浴蒸干，残渣用0.1%磷酸水溶液溶解定容至25 mL，微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。②阴性对照：按参柏湿疹搽剂处方工艺制备缺苦参的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制成缺苦参的阴性对照溶液。③混合对照品溶液：精密称取苦参碱对照品和氧化苦参碱适量，用0.1%磷酸水超声溶解，定容，得到70.4μg/mL苦参碱，19.2μg/mL氧化苦参碱混合对照溶液[2-7]。

2.1.2 色谱条件 Diamonsil C18(2)(250 mm×4.6 mm，5μm)，流动相为乙腈-甲醇-0.1%磷酸=3∶4∶93，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，波长220 nm，进样量20μL。

2.1.3 专属性试验 分别取混合对照品溶液，供试品溶液和阴性对照溶液20μL按照上述色谱条件进行测定，记录色谱(见图1)。结果表明，供试品溶液中苦参碱和氧化苦参碱色谱峰于相邻色谱峰有效分离，分离度均大于1.5，阴性对照表明无其他杂质干扰。

注：A.混合对照；B.样品；C.阴性对照。

2.1.4 线性关系 精密称取苦参碱对照品4.4 mg，氧化苦参碱对照品1.2 mg，加适量0.1%磷酸溶液超声溶解，定容至25 mL。分别取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，用0.1%磷酸溶液定容至5 mL，得到苦参碱17.6、35.2、70.4、105.6、140.8、176μg/mL和氧化苦参碱4.8、9.6、19.2、28.8、38.4、48μg/mL的混合对照溶液。以0.45μm的微孔滤膜过滤后按“2.1.2”色谱条件进样，记录峰面积，以峰面积为Y轴，对照品浓度为X轴，绘制标准曲线，进行线性回归，得到苦参碱回归方程为y=11 608x+38 703 (R2=0.999 5)，氧化苦参碱回归方程为y=12 758x+22 513(R2=0.999 9)，结果表明，苦参碱在17.6～176μg/mL质量浓度范围内，氧化苦参碱在4.8～48μg/mL质量浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.1.5 精密度 精密吸取制备好的同一供试品溶液20μL，按“2.1.2”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果显示，苦参碱、氧化苦参碱峰面积的RSD分别为0.943%、0.465%(n=6)，表明该色谱条件下方法精密度良好。

2.1.6 稳定性 精密吸取制备好的同一供试品溶液20μL，按“2.1.2”项下色谱条件，分别在制备样品后 0、2、4、6、8、10、24 h 进样，记录峰面积。结果显示，苦参碱、氧化苦参碱峰面积的RSD分别为1.23%、1.52%(n=6)，均>3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.7 重复性 取同一批次参柏湿疹搽剂，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，平行6份，按“2.1.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果显示，苦参碱、氧化苦参碱的平均含量分别为226.19、33.78μg/mL，RSD分别为 1.41%、1.75%(n=6)，均<3%，表明该方法重复性较好。

2.1.8 加样回收率 取已知含量的同一批次参柏湿疹搽剂2.5 mL，混合对照2.5 mL(其中苦参碱∶样品含量=0.5∶1，氧化苦参碱∶样品含量=1∶1)，再按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，平行制备6份，按“2.1.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算回收率。结果显示，苦参碱和氧化苦参碱的平均加样回收率分别为 105.36%、92.37%，RSD分别为2.68%、2.89%(n=6)，表明该方法准确度较好，结果见表1。

表1 苦参碱和氧化苦参碱加样回收测定结果 (n=6)

2.1.9 样品含量测定 取3个批次(批号20200423、20200522、20200624)参柏湿疹搽剂样品各一瓶，按照“2.2.1”项下方法制备供试品溶液各3份，供试品溶液及混合对照品溶液各20 μL，按“2.1.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品中苦参碱和氧化苦参碱的含量。结果显示，3个批次样品中苦参碱、氧化苦参碱的平均含量分别为208.44μg/mL、41.04μg/mL，平均总含量为249.48μg/mL。根据3批样品含量测定结果可知，制剂中苦参碱和氧化苦参碱总量的平均值为124.72 mg/瓶，按平均含量的80%设限，初步拟定以苦参碱、氧化苦参碱总量计，每瓶制剂中不得少于99 mg。样品中苦参碱、氧化苦参碱含量测定结果见表2。

表2 三批样品中苦参碱和氧化苦参碱含量测定结果 (μg/mL)

2.2 黄柏碱和小檗碱含量测定

2.2.1 溶液的制备 ①供试品溶液：取样品2.5 mL，加1%盐酸甲醇定容至5 mL，离心，取上清液微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。②阴性对照：按参柏湿疹搽剂处方工艺制备缺黄柏的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制成缺黄柏的阴性对照溶液。③混合对照品溶液：精密称取黄柏碱对照品和小檗碱适量，用50%(1%盐酸)甲醇水溶解，定容，得到15μg/mL黄柏碱，65μg/mL小檗碱混合对照溶液[8-12]。

2.2.2 色谱条件 Diamonsil C18(2)(250 mm×4.6 mm，5μm)，流动相为乙腈(A)-0.2%磷酸(每100 mL含十二烷基磺酸钠0.1g)(B)，梯度洗脱(见表3)，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，波长284 nm，进样量20μL。

表3 梯度洗脱程序

2.2.3 专属性试验 分别取混合对照品溶液，供试品溶液和阴性对照溶液20μL按照上述色谱条件进行测定，记录色谱(见图2)。结果表明，供试品溶液中黄柏碱和小檗碱色谱峰与相邻色谱峰有效分离，分离度均大于1.5，阴性对照表明无其他杂质干扰。

2.2.4 线性关系考察 精密称取黄柏碱对照品2.4 mg，50%(1%盐酸)甲醇水定容至10 mL，得0.24 mg/mL黄柏碱溶液。精密量取2.5 mL黄柏碱溶液置于10 mL容量瓶中，再加入精密称定的小檗碱对照品2.6 mg，用50%(1%盐酸)甲醇水定容至刻度，摇匀。分别取0.4、0.8、1.25、2.1、2.5 mL，用50%(1%盐酸)甲醇水溶液定容至5 mL，得到黄柏碱4.8、9.6、15、20.4、25.2、30μg/mL和小檗碱20.8、41.6、65、109.2、130μg/mL的混合对照溶液。以0.45μm的微孔滤膜过滤后按2.2.2色谱条件进样，记录峰面积，以峰面积为Y轴，对照品浓度为X轴，绘制标准曲线，进行线性回归，得到黄柏碱回归方程为y=28 545x+12 888 (R2=0.999 9)，小檗碱回归方程为y=51.187x+98.34 (R2=0.999 5)，结果表明，黄柏碱在4.8～30μg/mL质量浓度范围内，小檗碱在20.8～130μg/mL质量浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。

注：A.混合对照；B.样品；C.阴性对照。

2.2.5 精密度 精密吸取制备好的同一供试品溶液20μL，按“2.2.2”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果显示，黄柏碱、小檗碱峰面积的RSD分别为0.874%、1.643%(n=6)，表明该色谱条件下方法精密度良好。

2.2.6 稳定性 精密吸取制备好的同一供试品溶液20μL，按“2.2.2”项下色谱条件，分别在制备样品后 0、2、4、6、8、10、24 h 进样，记录峰面积。结果显示，黄柏碱、小檗碱峰面积的RSD分别为1.15%、1.90%(n=6)，均<3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.7 重复性 取同一批次参柏湿疹搽剂，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，平行6份，按“2.2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果显示，黄柏碱、小檗碱的平均含量分别为24.5、84.5μg/mL，RSD分别为 1.46%、2.16%(n=6)，均<3%，表明该方法具有良好的重复性。

2.2.8 加样回收率 取已知含量的同一批次参柏湿疹搽剂1.5 mL，混合对照1.5 mL(其中黄柏碱∶样品含量=2∶1，小檗碱∶样品含量=2∶1)，再按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，平行制备6份，按“2.2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算回收率。结果显示，黄柏碱和小檗碱的平均加样回收率分别为 98.52%、95.6%，RSD分别为2.67%、2.96%(n=6)，表明该方法准确度较好，结果见表4。

2.2.9 样品含量测定 取3个批次(批号20200423、20200522、20200624)参柏湿疹搽剂样品各一瓶，按照“2.2.1”项下方法制备供试品溶液各3份，供试品溶液及混合对照品溶液各20μL，按“2.2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品中黄柏碱和小檗碱的含量。结果显示，3个批次样品中黄柏碱、小檗碱的平均含量分别为25.39μg/mL、84.99μg/mL。根据3批样品含量测定结果可知，制剂中黄柏碱含量的平均值为12.70 mg/瓶，小檗碱含量的平均值为42.50 mg/瓶，按平均含量的80%设限，初步拟定以黄柏碱每瓶制剂中不得少于10 mg、小檗碱每瓶制剂中不得少于34 mg。样品中黄柏碱、小檗碱含量测定结果见表5。

表4 黄柏碱和小檗碱加样回收测定结果 (n=6)

表5 三批样品中黄柏碱和小檗碱含量测定结果

3 讨论

苦参和黄柏是参柏湿疹搽剂方中的君药，所以选择对苦参和黄柏进行定量检测，以苦参中主要有效成分苦参碱、氧化苦参碱，黄柏中的主要有效成分黄柏碱和盐酸小檗碱为检测指标建立了高效液相色谱含量测定方法。因为中药复方制剂中苦参碱和氧化苦参碱在一定条件下可以相互转化，所以选择苦参碱和氧化苦参碱的总量为检测指标。

苦参碱和氧化苦参碱加样对照品的配制方法，开始做加样回收率不理想，排除对照品经过样品处理方法会发生变化的可能，考虑到配制对照品的溶剂为0.1%磷酸水，而样品为水溶液，加入样品后可能会对含量产生影响，故调整对照品的配置溶剂为蒸馏水。考虑到制定标准曲线所用对照品的配制溶剂为0.1%磷酸水，在测加样回收样品前，测试样品含量，对照品含量，经过调整后，加样回收率正常。

黄柏碱和小檗碱对照品配制溶剂，检测黄柏碱和小檗碱时样品处理为取2.5 mL样品，加入1%盐酸甲醇定容至5 mL，目标峰型较好。对照品的配制原来使用50%的甲水配制，在加样回收时小檗碱回收率不理想。尝试甲醇，50%甲水和1%盐酸甲醇配制后，发现小檗碱的吸收峰面积会随着配制溶剂的不同而发生较明显的变化，故决定将对照品配制溶剂改为50%(1%盐酸)甲醇水，与样品处理后的溶剂一致，小檗碱的回收率也正常了。

综上所述，本研究建立了参柏湿疹搽剂中苦参碱、氧化苦参碱和黄柏碱、小檗碱的HPLC含量测定方法，并初步拟定了苦参碱和氧化苦参碱总量计，每瓶不少于99 mg，黄柏碱、小檗碱每瓶分别不少于10 mg和34 mg的质量标准。