补阳还五汤对间歇低氧大鼠胰腺应激蛋白及超微结构的影响

刘 丹，吴润华，魏 敏，陈 沁

（1.福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学临床技能教学中心，福建 福州 350122）

睡眠呼吸暂停综合征（OSAHS）是一种慢性睡眠障碍疾病，慢性间歇低氧（CIH）是其主要病理过程［1］。SENFT 等［2］研究发现，CIH 环境下细胞错误蛋白与非折叠蛋白增多，由此产生了内质网应激（ERS）反应，促进胰岛素抵抗（IR）形成。由此可见，OSAHS 和2型糖尿病在临床上相互影响，相互促进。研究表明，GRP78蛋白在ERS发生时表达上调，被认为是 ERS 的标志性因子［3］；在 ERS 诱导细胞凋亡的机制中，最常见的信号通路为CHOP 和Caspase-12，它们的升高同样提示内质网应激的发生［4］。补阳还五汤为益气活血之代表方剂［5］，在临床上对于改善OSAHS 患者症状具有良好效果，本研究通过间歇低氧处理制备CIH 动物模型，探讨补阳还五汤改善内质网应激反应的机制，为临床应用中药治疗OSAHS提供依据。

1 实验材料

1.1 动物 24 只 8 周龄 SD 雄性大鼠，SPF 级，体质量（180±20）g，购自上海SLAC实验动物有限公司，实验动物许可证号：SCXK（沪2017-0005），批号：2007000531494。

1.2 试药 补阳还五汤由黄芪30 g、当归尾9 g、赤芍12 g、地龙12 g、川芎 12 g、红花 3 g、桃仁3 g 组成。将上述药物置于煎煮锅内，加入5～7 倍药材量的水浸泡1 h，沸水煮30 min，过滤，剩余药渣再加入3～5倍量的水，沸水煮20 min，过滤。合并2次滤液，水浴浓缩至浓度为0.5 g/ml的药液，冷却后装进灭菌药瓶内，置于4 ℃保存。

1.3 试剂 胰岛素放射免疫法测定试剂盒（北京北方生物技术研究所）；Rabbit anti-rat Caspase-12 抗体（SANTA CRUZ 公司）；CHOP 抗体（SANTA CRUZ公司）；二抗（Zymed 公司）；GRP78试剂盒及二抗（赛默飞世尔科技有限公司）。

2 方 法

2.1 动物分组及处理 将24 只SD 大鼠根据随机数字表分为常氧对照组、模型组、补阳还五汤组，每组8只。模型组与补阳还五汤组通过间歇低氧处理制备CIH模型［6］：每天9：00至17︰00，将大鼠放置在低氧舱中，低氧舱用KY-2F型控氧仪调控氧气的浓度，达到后维持设定氧气浓度（氧浓度下限为5.1%，上限21%）。每一个循环都分成4 个阶段：下降期（50 s）、维持期（20 s）、上升期（30 s）、维持期（20 s），总共120 s，模拟中度OSAHS，其呼吸暂停低通气指数（AHI）：30次/小时。常氧对照组：每天9:00至17:00将动物置于同等条件舱，频率相同的间歇常氧（氧浓度为21%）处置，为期10周。造模第一天开始灌胃给药，补阳还五汤组每天在低氧前、后0.5 h给予补阳还五汤灌胃，每次9.6 g/kg；常氧对照组与模型组给予等容积生理盐水灌胃。期间均自由摄食及饮水，累计10周。

2.2 观察指标及方法 3 组大鼠取材前一晚禁食，测量体重后以10%的水合氯醛进行腹腔麻醉后，取胰体以及胰尾，以0.9%生理盐水洗去血液，置于EP管中，液氮中保存。

2.2.1 胰腺组织 GRP78、CHOP、Caspase-12 的蛋白表达 将胰腺行细胞沉淀，取其上清液，往上清液里加入2倍的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，加热10 min蛋白变性后，冷却，经电泳、转膜、封闭后，一抗孵育（1∶800 稀释）及二抗孵育（1∶10 000 稀释），利用ECL底物完成化学发光检测后进行定影。

2.2.2 胰腺细胞电镜观察 取出胰腺组织，4 ℃浸泡固定2 h（pH7.2），切成 1 mm×1 mm×3 mm 体积的组织块后，使用 PBS（0.07 mol/L）、蔗糖缓冲液（0.19 mol/L）进行清洗，再用锇酸（1.0%）、PBS（0.24 mol/L）固定2 h，漂洗、乙醇脱水，浸泡过夜，次日依次进行加温聚合（37 ℃保持12 h、45 ℃保持12 h、60 ℃保持 12 h），再进行超薄切片后，醋酸铀与枸橼酸铅电子染色，最后Hitachi-7500 型透射电镜行观察及摄像。

2.2.3 血清空腹血糖（FBG）、糖化血清蛋白（GSP）、空腹胰岛素（FINS）浓度的测定 采用日本京都血糖仪检测FBG，余血以3 500 r/min离心10 min后分离血清，应用果糖胺法测试GSP，酶联免疫方法检验FINS。

2.3 统计学方法 采用SPSS 22.0 统计软件进行数据分析处理，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05表示有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组大鼠血清FBG、GSP、FINS水平比较 见表1。

表1 各组大鼠血清FBG、GSP、FINS水平比较 （）

表1 各组大鼠血清FBG、GSP、FINS水平比较 （）

注：与常氧对照组比较，①P<0.05；与模型组比较，②P<0.05

组 别常氧对照组模型组补阳还五汤组n8 8 8 FBG（mmol/L）10.77±2.62 15.34±3.03①11.67±1.57②GSP（mmol/L）2.53±0.55 2.71±1.11 2.83±1.06 FINS（ng/ml）3.04±0.59 5.02±0.31①3.57±0.71②

表1 结果显示，与常氧对照组比较，模型组FBG、FINS 水平明显上升（P<0.05）；与模型组比较，补阳还五汤组FBG、FINS水平明显下降（P<0.05）；而三组GSP水平无显著性差异。

3.2 各组大鼠 GRP78、Caspase-12 和 CHOP 蛋白含量比较 见图1、表2。

表2 各组大鼠GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白表达 （）

表2 各组大鼠GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白表达 （）

注：与常氧对照组比较，①P<0.05；与模型组比较，②P<0.05

组 别常氧对照组模型组补阳还五汤组n8 8 8 GRP78 0.12±0.02 0.91±0.04①0.14±0.02②CHOP 0.12±0.01 0.69±0.05①0.13±0.02②Caspase-12 0.12±0.01 0.79±0.07①0.13±0.01②

图1 各组大鼠GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白表达

Western blotting 检测显示：与常氧对照组比较，模型组GRP78、CHOP、Caspase-12 蛋白表达水平显著升高（P<0.05）；与模型组比较，补阳还五汤组GRP78、CHOP、Caspase-12 表达水平显著降低（P<0.05），且与常氧对照组GRP78、CHOP、Caspase-12水平相当，无明显差异（P>0.05）。

3.3 各组大鼠胰腺细胞电镜观察结果 见图2。

图2 各组大鼠胰腺超微结构

电镜结果显示：常氧对照组大鼠胰腺的细胞核膜完整，线粒体丰富整齐，线粒体嵴呈同心圆排列，密集清晰；粗面内质网丰富，清晰呈条索状。模型组可见核膜不规则缺损，线粒体膜缺损，可见空泡变性的线粒体、伴有嵴距离扩张及断裂；同时出现扩张的粗面内质网，炎症细胞浸润。补阳还五汤组线粒体排列较整齐，与模型组相比空泡变性、肿胀、嵴扩张减轻；粗面内质网轻度扩张、变形，排列较规律。

4 讨 论

OSAHS 以夜间反复发生的低氧血症和（或）呼吸暂停为主要特征，其与2 型糖尿病在临床、流行病学和发病机制方面密切相关。而睡眠呼吸紊乱是引起胰岛素抵抗的主要因素［7］。本研究结果表明，模型组空腹血糖、空腹胰岛素水平均高于常氧对照组，差异具有统计学意义，提示间歇低氧可引起胰岛素抵抗、胰岛β 细胞功能下降，其机制可能为夜间反复暂停呼吸会导致体内缺氧以及高碳酸血症，降低胰岛素受体亲和力；且反复低氧应激反应，可使得多种拮抗胰岛素产物如儿茶酚胺、糖皮质激素、胰高血糖素等增多，加重胰岛素抵抗。OSAHS 由于慢性间歇低氧引起机体的病理生理变化，其中内质网应激发挥了很大的作用［8］。GRP78参与前体蛋白转运及其折叠、组装和运输，包括错误折叠和组装蛋白质的输出及相关降解，调节与ERS 相关的3 条主要信号通路（CHOP 信号通路、凋亡信号调节激酶1-JNK 信号通路和Caspase-12信号通路），调节内质网内稳态的诸多生物学过程［9］。在正常生理状态下，CHOP一般无法测到，它是位于内质网腔的促凋亡分子，在ERS状态下表达显著增高，是ERS 的标志［10］。Caspase-12 是介导ERS 诱发凋亡的关键分子，NAKAGAWA等［11］研究发现，Caspase-12 基因敲除细胞能抵抗ERS 诱导的细胞凋亡，而将激活的Caspase-12 导入细胞会促使细胞凋亡。本研究结果显示模型组的内质网应激分子GRP78、CHOP、Caspase-12 蛋白表达均高于常氧对照组，说明间歇低氧会引起胰腺细胞内质网应激反应，从而导致胰腺细胞损伤。

中医认为阻塞性睡眠呼吸暂停综合征属于“鼾症”的范畴，是由痰湿内阻、气滞血瘀引起的，可根据患者临床证候分为痰湿内阻型、脾肾阳虚型、气滞血瘀型等。补阳还五汤源自清代王清任的《医林改错》，为益气活血之代表方剂，由黄芪、当归尾、赤芍、地龙、川芎、红花、桃仁组成，具有抗氧化作用，能减轻自由基代谢紊乱，具有补气、活血、通络之功效，在临床上对于改善OSAHS 患者症状具有良好效果。本课题组前期临床研究结果表明益气祛痰中药可明显改善老年阻塞性睡眠呼吸暂停综合征患者的临床症状、AHI指数、最低血氧饱和度（LSaO2）、氧化应激反应及炎症反应［12-13］。本研究结果表明，予补阳还五汤干预后胰腺细胞内质网应激GRP78、CHOP、Caspase-12 蛋白表达均明显降低，胰腺细胞结构较模型组完整，提示该方可能通过下调胰腺GRP78、CHOP、Caspase-12 蛋白表达，来改善胰腺组织的细胞ERS的水平，从而保护胰岛β细胞。