野生欧洲李离体叶柄再生体系的建立*

陈 曦，耿文娟

（新疆农业大学园艺学院，乌鲁木齐830052）

野生欧洲李（Prunus domesticaL.）俗名野酸梅，属于蔷薇科（Rosaceae）李属（Prunus）植物，为灌木或小乔木，树高1.0～2.5 m，是新疆珍稀的野生植物之一[1-2]。自1980 年施丽首次在新疆新源县交吾托海野果林发现，认为新疆伊犁天山野果林是欧洲李的唯一起源地[3-4]。之后有学者陆续发现了其余6 处生存分布点，据调查表明，野生欧洲李仅分布在我国新疆伊犁地区的新源县和巩留县，零散分布，个别分布点仅有几株，其只有在温湿的阴坡面或近水边才能较好地生存，抗性较弱，且生长状况逐年衰弱[5-8]。野生欧洲李因其含酸量高，适合加工成李产品，也具有药用和营养价值，有一定的经济效益，但野生分布的欧洲李还没有开发利用[6,9]。当前由于生存环境恶劣、过度放牧开垦和人为破坏等因素，造成野生欧洲李种群数量逐年减少，生存面积骤缩，已处于濒危状态[10]。研究并建立多层次保护保存体系，对新疆野生欧洲李果树资源的保护具有重要的现实意义。

近年来，植物组织培养技术在我国发展迅猛，不仅繁殖周期短、速度快，人为控制下可实现工厂化批量生产育苗，也对新品种的遗传改良、种质资源的保存和濒危植物种群数量的扩大有重要意义[11-13]。如今在核果类果树育种应用上也越来越广泛。在桃[14-15]、樱桃[16-17]和杏[18-19]等果树中报道较多，而关于李的研究报道较少，Nowak 等[20]以欧洲李试管苗上部第2～3 片完全展开的带叶柄的叶片为试材，得到再生植株。樱桃李作为欧洲李的亲本之一，刘崇琪等[21]采用新疆野生樱桃李试管苗叶片为试材也得到了再生植株。姚延兴[22]则以欧洲李‘Tardicots’的叶柄为试材，不定芽的再生率可达83.33%。而针对野生欧洲李叶柄再生的研究还未有报道，组培苗叶柄和野外采摘的叶柄材料相比，污染低，分化能力强。因此，以近年来对野生欧洲李茎段和叶片组织培养的研究为基础[23-25]，采用野生欧洲李试管苗幼嫩叶片上的叶柄作为外植体，探究暗培养时间、基础培养基类型、植物生长调节剂种类及配比对叶柄离体再生的影响，期望建立高效稳定的野生欧洲李叶柄离体培养再生植株体系，对野生欧洲李资源的保护提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新疆野生欧洲李组培苗材料采自新疆伊宁市新源县交吾托海（野生欧洲李原生分布地之一），25 d 左右继代1 次。取叶龄在25～30 d 的组培苗，选取上部分完全展开的3～6 片幼嫩叶片的叶柄作为外植体，接种到各处理的培养基中，培养箱温度为（25±1）℃。

1.2 试验方法

1.2.1 暗培养时间的筛选

设计5 组暗培养时间，依次为0、7、14、21、28 d，每个处理接种30 个外植体。培养基配方为B5＋0.2 mg/L 6-BA＋1.5 mg/L NAA＋30 g/L 蔗糖＋7 g/L 琼脂，pH 值为5.5±0.1，30 d 后统计离体叶柄不定芽诱导率，并观察记录生长状况。

不定芽诱导率（%）＝（叶柄出芽数/接种总数）×100

1.2.2 基础培养基类型的筛选

选取B5、WPM、MS（合肥巴斯夫生物科技有限公司）3 种不含琼脂和蔗糖的基础培养基，每个处理接种30 个外植体。培养基配方同1.2.1，30 d 后统计离体叶柄不定芽诱导率，并观察记录生长状况。

1.2.3 初代培养中植物生长调节剂浓度配比的筛选

初代培养中基础培养基选用B5＋30 g/L 蔗糖＋7 g/L 琼脂，植物生长调节剂选取6-BA（0.1、0.2、0.3 mg/L）和NAA（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L），共15 个处理，每个处理接种30 个外植体，30 d 后统计离体叶柄不定芽诱导率，并观察记录生长状况。

1.2.4 不定芽增殖培养中植物生长调节剂浓度配比的筛选

不定芽增殖培养中基础培养基选用B5＋30 g/L蔗糖＋7 g/L 琼脂，植物生长调节剂选取6-BA（0.5、0.6、0.7 mg/L）和NAA（0.2、0.3 mg/L），共6 个处理，每个处理接种15 个不定芽，30 d 后统计离体叶柄再生不定芽增殖系数，并观察记录生长状况。

不定芽增殖系数＝30 d 后不定芽总数/接种前不定芽数

1.2.5 生根培养中植物生长调节剂浓度配比的筛选

待离体叶柄诱导的不定芽苗长到1.5 cm左右转接到继代培养基中，继代培养1～2 次后可诱导生根。生根培养中基础培养基选用1/2 MS 或B5＋30 g/L 蔗糖＋7 g/L 琼脂，植物生长调节剂选取IBA（0.4、0.5、0.6、0.7 mg/L），共8 个处理，每个处理接种10 瓶，每瓶接种1～2 个不定芽苗，30 d 后统计离体叶柄再生苗生根率，并观察记录生长状况。

2 结果与分析

2.1 不同暗培养时间对离体叶柄诱导不定芽的影响

不同暗培养时间对叶柄不定芽诱导率有明显影响，未经过暗培养的叶柄不定芽诱导率为0，褐化严重；暗培养21 d 处理的叶柄再生的不定芽长势良好，不定芽诱导率最高，为33.3%；而暗培养28 d 处理的叶柄完全愈伤化，并分化出少量不定芽（表1，图版1-A）。

表1 不同暗培养时间对离体叶柄诱导不定芽的影响

2.2 不同基础培养基类型对离体叶柄诱导不定芽的影响

叶柄只有在B5 培养基中再生出不定芽，诱导率为26.7%，不定芽长势好，未分化出不定芽的叶柄全部愈伤化，有松软质地和偏硬质地2 种愈伤组织；在WPM 和MS 培养基中叶柄不定芽诱导率皆为0，愈伤组织生长状况也较差（表2）。

表2 不同基础培养基类型对离体叶柄诱导不定芽的影响

2.3 初代培养中不同植物生长调节剂浓度配比对离体叶柄诱导不定芽的影响

在B5 培养基中，添加不同浓度配比的植物生长调节剂6-BA 和NAA对叶柄再生不定芽有明显影响，添加0.1 mg/L 6-BA 时，仅有处理1 再生出不定芽，长势较弱，最后死亡。添加0.2 mg/L 6-BA时，处理7、8、9、10 均有不定芽再生，其中处理8 的诱导率最高，为30.0%，不定芽长势好，生长健壮（图版1-B、C）；处理9 有不定芽再生，同时也有不定根再生（图版1-D），随着NAA 浓度的增加，不定芽发生玻璃化现象。添加0.3 mg/L 6-BA 时，5 组处理均无不定芽再生，部分叶柄愈伤化（表3）。

表3 初代培养中不同植物生长调节剂浓度配比对离体叶柄诱导不定芽的影响

2.4 增殖培养中不同植物生长调节剂浓度配比对不定芽增殖的影响

以B5 作为增殖培养中的基础培养基，随着植物生长调节剂6-BA 浓度的增加，不定芽增殖效果更明显，在添加0.7 mg/L 6-BA 时的增殖系数最高，为2.8，不定芽长势好，叶绿且苗高；添加0.3 mg/L NAA 效果优于0.2 mg/L NAA，处理2、4、6 的增殖系数明显高于相同6-BA 浓度的其他3 个处理，梢的伸长生长效果也好，利于后续继代培养（表4）。添加0.7 mg/L 6-BA 和0.3 mg/L NAA 的培养基中不定芽增殖和生长效果较好（图版1-E）。

表4 增殖培养中不同植物生长调节剂浓度配比对不定芽增殖的影响

2.5 在B5 和1/2 MS 培养基中IBA 浓度对不定芽苗生根的影响

在B5 和1/2 MS 培养基中添加不同浓度的IBA，所有处理均有生根现象，但长势不一，IBA 浓度相同的条件下，在B5 培养基中生根效果好于1/2 MS培养基，但这2 个培养基中生根率最高都为20%，随着IBA 浓度的增加，长势也越差，叶片发黄，根部褐化。在B5＋0.6 mg/L IBA 处理中，叶柄生根苗长势好，20 d 左右后基部有根的发生，单根现象居多，培养一段时间根长8.0 cm 左右，且单根上有较多侧根，有5～8 条，根基部都伴有少许愈伤组织（表5，图版1-F）。

表5 在B5 和1/2 MS 培养基中IBA 浓度对不定芽苗生根的影响

3 讨 论

3.1 暗培养时间对野生欧洲李离体叶柄再生不定芽的影响

在核果类果树叶片组织培养的报道中，暗培养是影响叶片诱导愈伤组织和不定芽再生的重要因素之一。刘崇琪等[21]在新疆樱桃李组培苗叶片诱导不定芽研究中发现，未经暗培养的叶片不能诱导不定芽，经过14 d 暗培养后的叶片诱导不定芽效果最好。刘航空等[26]也在诱导油桃叶片胚性愈伤组织的研究中发现，经暗培养21 d 时，有利于愈伤组织的产生，并进一步分化再生了8.0%的不定芽。欧洲李试管苗叶片（带叶柄）离体培养也经过21 d 暗培养，诱导出不定芽并获得了再生植株[22]。本试验也得到了相同结果，发现在暗培养21 d 时，叶柄可直接再生不定芽或经过少量愈伤组织再生出不定芽，诱导率为33.3%。但在暗培养28 d 时，叶柄完全愈伤化，愈伤组织质地较硬，也再生出少量不定芽，而暗培养时间太短，则不能再生不定芽，说明只有适宜的暗培养时间才能使外植体再生不定芽。

3.2 基础培养基类型对野生欧洲李离体叶柄再生的影响

基础培养基是保证外植体存活状况与生理活动的最基本物质，在核果类组织培养中，MS 培养基应用较广泛，不同树种选用的基础培养基也不同。在李组织培养中，邹英宁等[27]研究表明，1/2 MS培养基和WPM 培养基对‘海湾红宝石’李茎段离体再生效果较好，生根率分别为10.4%和10.1%，生根倍数均为2.0。孙清荣等[28]对欧洲李‘红艳1 号’茎段初代培养中发现基础培养基QL 比MS 有效，增殖培养时MS 培养基效果好于QL 和WPM。吴建华等[29]以欧洲李幼嫩茎段为试材，丛生芽的诱导和增殖在MS 培养基中效果最佳。在本试验中，比较了B5、MS 和WPM 3 种基础培养基对离体叶柄不定芽诱导的影响，发现只有在B5 培养基中再生出不定芽，MS 和WPM 培养基中不定芽诱导率均为0；在B5 和1/2 MS 培养基中均有生根现象，但在1/2 MS培养基中长势较弱，表明B5 培养基对野生欧洲李离体叶柄再生效果最好，和前人研究结果一致。

3.3 植物生长调节剂种类及其浓度配比对野生欧洲李离体叶柄再生的影响

植物生长调节剂种类及其浓度配比对外植体愈伤组织的诱导、不定芽分化起关键作用，不同的品种选用的植物生长调节剂浓度也不同，也影响其生长状况。彭丽萍等[30]选用6-BA＋2,4-D 组合对中国樱桃试管苗叶片诱导愈伤组织，在部分含有叶柄的叶基部诱导率可达100%，在中国李‘Nubiana’离体叶柄培养中添加0.2 mg/L TDZ＋1.65 mg/L 2,4-D 对不定芽再生效果好，而在樱桃李中添加1.8 mg/L 2,4-D 对不定芽再生效果好，二者诱导率分别为31.7%和36.7%[15]。在前期预试验中也选用7.5 mg/L TDZ，对愈伤组织诱导较好，但未诱导出不定芽，而选取0.2 mg/L 6-BA＋1.5 mg/L NAA 对野生欧洲李离体叶柄不定芽再生效果好，当添加2.0 mg/L NAA 时，离体叶柄直接分化出不定根。中国李‘帅李’在生根培养基中添加0.5 mg/L NAA，生根率为33.3%[31]。本研究中生根培养基中添加IBA 对不定芽诱导生根效果好，但生根率仅有10%～20%。在后续的研究中，可不断优化基础培养基类型和植物生长调节剂种类及其浓度配比来提高生根率。

4 结 论

野生欧洲李试管苗叶柄最佳暗培养时间为21 d，适合初代培养诱导不定芽再生的培养基为：B5＋0.2 mg/L 6-BA＋1.5 mg/L NAA＋30 g/L 蔗糖＋7 g/L 琼脂，诱导率为30.0%；适合不定芽增殖的培养基为：B5＋0.7 mg/L 6-BA＋0.3 mg/L NAA＋30 g/L蔗糖＋7 g/L 琼脂，增殖系数为2.8；适合不定芽生根的培养基为：B5＋0.6 mg/L IBA＋30 g/L 蔗糖＋7 g/L 琼脂，生根率为20%，培养基pH 值均为5.5。