纳米抗体研究热点CiteSpace文献可视化分析

武瑞君，杨 喆，桑晓冬，李治非，魏 巍，敖 翼，范 玲

（中国生物技术发展中心，北京 100039）

1993年，在羊驼外周血中发现了一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含1个重链可变区（vari⁃able domain of heavy chain of heavy-chain，VHH）和2个常规的重链恒定区CH2和CH3区［1］。克隆其可变区可得到只由VHH构成的单域抗体（single-domain antibody），称为VHH抗体，即纳米抗体。纳米抗体是目前已知最小的天然功能性抗原特异性结合片段，依赖3个互补决定区（comple⁃mentarity determining regions，CDR）即 CDR1，CDR2和CDR3与抗原决定簇发生相互作用［2］。纳米抗体的发现突破了传统抗体因分子质量过大（约150 ku）导致的免疫原性强、组织穿透力差、结构改造较难等瓶颈，在具有与传统抗体相当的抗原亲和力的同时具有多种优点：①分子质量小，只有约15 ku，在体内具有较强的组织穿透性；②作为单域结构，稳定性强，且易进行双特异性或多特异性抗体的重组改造；③CDR3较长，结合抗原的方式更加灵活，可以结合抗原的隐藏表位；④纳米抗体和人源抗体可变区的氨基酸序列相似度很高，免疫原性较小，易于进行人源化改造和临床应用。2021年1月11日，德国《法兰克福汇报》网站刊载题为《迈向新境界——量子计算机、纳米抗体、新逻辑：2021年将带来哪些技术突破？》的报道［3］，随着新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）疫情的暴发，纳米抗体相关研究越来越引人关注。

CiteSpace文献可视化分析工具可通过对某一主题或研究领域内的大量文献数据进行共现和共被引分析等，筛选出该领域的关键研究成果，呈现研究领域的发展趋势和研究热点。此方法能够提供传统文献综述以及系统综述所不具备的视角，目前已在国内外众多领域有所应用［4］。本文旨在应用文献可视化分析方法，呈现纳米抗体领域的发展趋势和热点主题，为纳米抗体的深入研究提供参考。

1 数据来源和检索策略

文献资源来源于Web of Science检索平台（Thomson Reuters，美国）的Web of Science核心合集。在上述数据库中以关键词（“nanobody”OR“single domain antibody”OR“VHH antibody”）进行主题检索，检索时间范围为2005.01.01—2021.06.30。对纳入的文献类型限定为论著类文献和综述类文献，并排除非英语文献的相关研究。

根据发文量增加速度，整个时间跨度可大致分为2个阶段。第一阶段为自1993年第1次发现纳米抗体起，相关研究属于起步阶段，全球范围内年均发文量较少；第二阶段从2006年至今，2006年相关发文量较2005年出现井喷式增加，之后逐年递增，2020年发文量第1次超600篇，预计2021年发文量可达600篇以上。检索获得2005.01.01—2021.06.30关于纳米抗体研究的文献记录共6357条，其中论著类文献5725条、综述类文献632条；被引频次总计159 940次，平均每篇文献被引用25.16次。分析近16年发表的文献，年发文量整体呈逐年递增趋势（图1）。

图1 纳米抗体相关研究年度发文量.文献检索自Web of Science检索平台的Web of Science核心合集，检索主题词为“nanobody”或“single domain antibody”或“VHH antibody”，检索时间范围为2005.01.01—2021.06.30，检索文献类型为论著类和综述类的英文文献.

2 数据分析

以纯文本的格式导出检索结果的全记录与引用的参考文献，然后导入CiteSpace 5.7.R5软件。参数设置如下，时间分区（time slicing）为2005.01.01—2021.06.30；时间切片（year per slice）设为2年；选择标准（selection criteria）选择TOP N，设置为30，即从每个时间切片中选择最常被引用或最常出现的30个条目；图谱剪切方式（pruning）采用寻径网络（pathfinder）、切片网络修剪（pruning sliced network）和整体网络修剪（prun⁃ing the merged network）。

根据不同的目的设置不同的节点类型（node types）。通过国家或地区（country）、机构（institu⁃tion）和作者（author）共现分析，可以提示不同国家、机构和作者的合作关系。通过文献（reference）共被引分析，计算文献被引频次和中介中心性（cen⁃trality）等参数，找到研究领域发展过程中的关键文献。其中，中介中心性是指网络中经过某点并连接这2点的最短路径占2点间最短路径线总数之比，中介中心性高的节点可视为关键节点，提示研究领域知识结构发展。通过突显性时间分布，找到不同时间段突显性高的文献，提示研究领域的发展趋势，预测潜在研究热点。通过关键词（keyword）共现分析，分析出现频次较高的关键词，并对关键词进行聚类分析，反映领域研究热点和主要研究方向。其中，聚类结果以聚类模块值（modularity，Q值）和聚类平均轮廓值（silhouette，S值）进行评估，值越大表示网络的聚类结果越好。一般Q>0.3表示聚类结构显著，S>0.5表示聚类合理，S>0.7表示聚类令人信服［5］。

2.1 国家、机构和作者可视化分析

用CiteSpace分析得到N（网络节点数量）=57、E（连线数量）=57的国家或地区合作图谱（图2），得到N=192，E=179的机构合作图谱（图3）。发文量排名前5的国家为美国、中国、德国、比利时和英国，中心性排名前5位的国家为英国、美国、中国、澳大利亚和新加坡（表1）。发文量排名前5位的机构为比利时布鲁塞尔大学、比利时弗兰德生物技术研究院、荷兰乌得勒支大学、比利时根特大学和中国科学院，中心性排名前5位的机构为牛津大学、加利福尼亚大学戴维斯分校、纽约血液中心、比利时布鲁塞尔大学和得克萨斯大学（表2）。

图2 纳米抗体相关研究国家或地区合作图谱.数据来源见图1.CiteSpace 5.7.R5软件参数设置：时间分区为2005.01.01—2021.06.30，时间切片为2年，选择标准为TOP N=30，图谱剪切方式采用寻径网络、切片网络修剪和整体网络修剪，节点类型为国家或地区.

图3 纳米抗体相关研究机构合作图谱.数据来源见图1.CiteSpace 5.7.R5软件参数设置见图2，节点类型为机构.

表1 纳米抗体相关研究发文量及中心性前5位的国家

表2 纳米抗体相关研究发文量及中心性前5位的机构

根据可视化分析结果可以发现，在全球范围内，纳米抗体研究产出量呈逐年递增趋势，研究广泛覆盖美国、欧洲及亚洲在内的各个地区，说明纳米抗体相关研究越来越被重视，是近年来全球共同关注的重要热点方向。在该领域占主要地位的是美国、中国、德国和比利时，这些国家发文量较多，且合作较为密切。综合发文量和中心性分析得知，比利时布鲁塞尔大学称得上是该领域的权威机构。我国关于抗体药物的研究和开发虽然起步较晚，但在国家的引导和支持下，我国新药研发与国外一些发达国家医药水平的差距越来越小。在纳米抗体研究领域，我国发文量已排第2位，中国科学院是发文量排名前5位的机构之一。但在与其他国家专家的合作、研究的系统性和引领性等方面，我国仍存在较大不足，需进一步提高。

生成的作者合作图谱（图4，N=405，E=654）显示纳米抗体研究相关领域发文量较多且较有影响力的团队及具有潜在合作关系的作者信息，协助研究人员和不同研究小组建立合作关系。表3显示纳米抗体领域研究发文量排名前5位的作者，其中比利时布鲁塞尔大学学者Serge MUYLDER⁃MANS 以发文量 132 篇［2，6］排名第1位，中心性也排名第1位，且拥有丰富的合作网络，说明该专家为纳米抗体领域的权威专家。该专家所在团队于1993年首次报道了纳米抗体的相关特性，并长期致力于研究纳米抗体的结构、特征、应用和开发工具等。此外，发文量排名前5位的作者中，有4位比利时学者［7-9］，1位美国学者［10］。图4显示作者合作图谱，发文量排名前5位的作者均具有较好的合作网络。另外全球范围内，也存在分别以Zhui TU和Sabrina OLIVEIRA等学者为核心的小范围合作研究。

图4 纳米抗体相关研究作者合作图谱.数据来源见图1.CiteSpace 5.7.R5软件参数设置见图2，节点类型为作者.

表3 纳米抗体相关研究发文量以及中心性前5位的作者

2.2 关键文献可视化分析

图5为文献共被引网络图谱（N=213，E=238），分别以被引频次和中心性为参数，统计排名前5位的研究，共确定11篇关键节点文献（表4和表5），是纳米抗体领域研究人员的重要参考。文献突显性分析结果显示，共有25篇文献突显强度达到19以上，表6所示为突显强度前10位的文献，可能提示未来的研究热点。其中，Muyldermans 等［15］于2013年在Annu Rev Biochem期刊发表的题为“Nanobodies：natural single-domain antibodies”的文章，被引频次最高（达306次），突显强度最高（高达105.23），是推动纳米抗体研究发展的重要文献之一。该文献对纳米抗体进行了系统综述，认为纳米抗体从研发工具到治疗药物均具有广泛的应用前景。

表4 纳米抗体相关研究被引频次排名前5位的关键节点文献

表5 纳米抗体相关研究中心性排名前5位的关键节点文献

表6 纳米抗体相关研究突显强度最高的前10位参考文献

图5 纳米抗体相关研究文献共被引网络图谱.数据来源见图1.CiteSpace 5.7.R5软件参数设置见图2，节点类型为文献.

2.3 关键词可视化分析

关键词是对文章内容的高度概括，是对文章主题的反映。出现频次较高的关键词通常能够反映该领域的研究热点和主要研究方向。用CiteSpace构建关键词共现图谱（图6，N=63，E=65），按照出现频次排序，得到单克隆抗体、纳米抗体、抗体、表达、蛋白质、片段、晶体结构、噬菌体展示、诊断、肿瘤、治疗和感染等关键词。按照中心性排序，得到片段、重链抗体、肿瘤、亲和力、血管生成、可变域、大肠杆菌、噬菌体展示、感染、免疫治疗和中和抗体等关键词。

图6 纳米抗体相关研究关键词共现图谱.数据来源见图1.CiteSpace 5.7.R5软件参数设置见图2，节点类型为关键词.

用CiteSpace对关键词进行聚类，采用对数似然率算法，通过提取文献的关键词进行聚类命名，最终形成了8个聚类（图7）。本次聚类S=0.9341，Q=0.7799，聚类结果较好。按每个聚类S值由高到低进行排序，分别为#3纳米抗体、#6单克隆抗体、#2免疫治疗、#7晶体结构、#4抗体、#5噬菌体展示、#1域和#0诊断，其中#3纳米抗体、#6单克隆抗体和#2免疫治疗3个聚类的S值均为1。

图7 纳米抗体相关研究关键词聚类图谱.数据来源见图1.CiteSpace 5.7.R5软件参数设置见图2，节点类型为关键词，并对关键词进行聚类分析.

3 纳米抗体热点研究领域分析

通过对上述可视化分析结果和相关文献进行认真分析和深入挖掘，发现纳米抗体在感染性疾病、肿瘤类疾病和免疫类疾病的预防、诊断和治疗中的应用，是当前主要的研究热点。

3.1 疾病预防

目前纳米抗体在疾病预防领域的研究主要是针对传染类疾病。纳米抗体可通过与致病微生物的关键蛋白结合，控制传染源或切断传播途径，以达到预防疾病的目的。弯曲杆菌感染是人类最常见的食源性感染之一，Vanmarsenille等［31］以弯曲杆菌属为研究靶点，开展纳米抗体研发工作。研究团队开发了6个具有广泛特异性的纳米抗体，通过识别空肠弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌外膜蛋白，导致弯曲杆菌属细胞凝集，抑制弯曲杆菌属在鸡肠道内的定植，阻断细菌传播，达到预防弯曲杆菌属感染的目的。Amcheslavsky等［32］以具有较大异质性的产肠毒素大肠杆菌为靶标，筛选了对11种主要致病性产肠毒素大肠杆菌具有体外交叉保护效力的纳米抗体，经胃给药，在小鼠模型中显示出显著减少细菌定植的作用。

许多病原体和外部有害物质通过胃肠道黏膜进入人体，研发靶向黏膜表面受体的疫苗被认为是一种能有效诱导黏膜免疫反应的方法。但是口服亚单位疫苗在肠道上皮细胞存在吸收差、转运效率低和免疫反应弱等问题。研究表明，克服上述障碍的一种策略是利用疫苗抗原递送载体，将氨肽酶N（aminopeptidase N，APN）特异性靶向药物与疫苗抗原结合，激发肠道黏膜免疫反应，其中APN是位于小肠细胞和抗原呈递细胞上的受体。Bakshi等［33］使用猪APN免疫美洲驼并筛选出表达pAPN的细胞系，通过该细胞筛选系统，筛选到28个抗猪APN的纳米抗体，通过与常规抗体的Fc结构域融合，形成二价融合蛋白（VHH-MG）。利用仔猪肠道结扎环实验和口服免疫实验发现，在生理条件下，3L94-MG和2L65-MG显示出在小肠上皮细胞内的有效吞噬作用，经口服给药可引发全身和黏膜抗体反应。下一步，可将临床相关抗原与上述猪APN特异性纳米抗体结合，以评估其作为疫苗抗原呈递载体、口服触发肠道上皮保护性免疫反应的可能性。

此外，纳米抗体也有望成为预防SARS-CoV-2感染的重要手段。Pymm等［34］利用SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域免疫羊驼，筛选出对SARSCoV-2具有高亲和力、结合位点不同的纳米抗体。将纳米抗体与Fc融合构成纳米抗体-Fc融合体，其中4种纳米抗体-Fc融合体在体外细胞模型中可以在0.1 nmol·L-1浓度下有效中和野生型SARS-CoV-2原始株和N501Y、D614G突变株。在感染N501Y和D614G SARS-CoV-2突变株的小鼠模型中，使用纳米抗体-Fc单一融合体或混合疗法进行预防性给药，与不给药组相比，给药组小鼠体内SARSCoV-2载量降低至万分之一。

3.2 疾病诊断

由于与抗原结合的强特异性、高亲和力和优良的组织穿透性，纳米抗体在疾病诊断领域也有较多应用。纳米抗体技术最初多被采用酶联免疫吸附法、双抗夹心法等进行体外检测。使用较为广泛的是双抗夹心法，此方法包含2种能与抗原不同表位结合的纳米抗体，组成“纳米抗体1-抗原-纳米抗体2”的“三明治”结构。纳米抗体1一般固定于载体上用于捕获待测抗原，纳米抗体2用于抗原浓度的间接检测［35］。Zhu等［36］研发的靶向甲型H5N1流感病毒的纳米抗体线性检测范围50～1000 μg·L-1，检测限为14.1 μg·L-1，优于目前Binax公司商用流感病毒诊断试剂。Wang等［37］首次从免疫后的双峰驼中筛选出与载脂蛋白A1不同表位结合的纳米抗体Nb11和Nb19。将Nb11作为捕获抗体并固定在金纳米粒子修饰的丝网印刷碳电极上，负载纳米羟基磷灰石的银纳米颗粒用作信号标签标记二抗Nb19。该方法对载脂蛋白A1的检测范围为0.0001～50 μg·L-1，检测限为0.02 ng·L-1。

随着现代技术的不断发现和更新，以纳米抗体为基础的靶向示踪成为分子成像等在体无创伤诊断领域的重要研究方向，纳米抗体可用作靶向示踪分子进行病灶组织特异的放射免疫显像或靶向超声造影。表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor，EGFR）作为一种跨膜蛋白，在乳腺癌、胃癌、结肠癌和卵巢癌等多种肿瘤组织中过表达，开发靶向EGFR的纳米抗体作为显像剂载体，用于乳腺癌等肿瘤的诊断是重要研究方向之一。Huang等［38］研发了靶向EGFR的纳米抗体8B6，荧光激活细胞分选技术分析显示，8B6纳米抗体仅识别过表达EGFR的细胞。通过C端组氨酸尾将8B6用同位素Tc-99m标记，组成Tc-99m-8B6纳米抗体示踪剂，在小鼠体内使用单光子发射计算机断层扫描对EGFR过表达肿瘤进行体内放射免疫检测。结果显示，Tc-99m-8B6能明显区分体内EGFR高、中度表达的肿瘤，且在体内血液清除速度相对较快，半衰期为1.5 h，主要通过肾清除。

3.3 疾病治疗

纳米抗体在疾病治疗领域的应用主要集中在免疫疾病治疗、感染性疾病治疗和肿瘤治疗等方面。

在免疫疾病治疗方面，比利时生物制药公司Ablynx开发的卡普赛珠单抗（caplacizumab）纳米抗体药物，通过靶向血管血友病因子（von Wille⁃brand factor，vWF），用于治疗自身免疫性疾病：获得性血栓性血小板减少性紫癜（acquired thrombotic thrombocytopenic purpura，aTTP）。该药已分别于2018年9月和2019年2月获得欧盟和美国批准，是目前唯一获批上市的纳米抗体药物。在卡普赛珠单抗上市前，aTTP无特异性疗法，只能采用血浆置换或者免疫抑制来缓解，且存在治疗后易发生治疗耐受，停止血浆置换后病情迅速进展等问题，死亡率高达10%～20%。卡普赛珠单抗为首个针对aTTP的特异性疗法，是1种二价的vWF抗体。在结构上，该单抗包含259个氨基酸，通过3个丙氨酸（AAA）的连接子，连接2个抗vWF的纳米抗体。该单抗在体内通过直接结合vWF的A域蛋白，一是增加自身分子质量，克服纳米抗体本身半衰期短的缺陷，延长半衰期达10～30 h；二是防止vMF与血小板结合，阻止血小板性微血栓的形成，且在血中快速均匀分布，药效稳定［39］。研究人员也在积极研究针对类风湿性关节炎和银屑病等自身免疫性疾病的纳米抗体。Pan等［40］开发了1种靶向胰高血糖素样肽1受体的双特异性纳米抗体埃维瑞单抗（everestmab）。在糖尿病模型大鼠中，单次注射该单抗可显著降低大鼠血糖，并且在抑制大鼠体重减轻和糖化血红蛋白降低及减轻葡萄糖耐受性、肝功能和胰腺胰岛功能损害等方面具有一定疗效。

在感染性疾病治疗方面，相关研究主要集中在病毒感染、细菌感染和寄生虫感染等领域。呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是引起严重下呼吸道感染的最常见原因，目前暂无有效的治疗方法。ALX-0171是Ablynx公司研发的具有抗RSV作用的新型三价纳米抗体，目前正处于临床试验阶段。2020年9月公布的Ⅱb期临床试验结果显示，使用ALX-0171吸入治疗RSV下呼吸道感染的住院儿童，显示出良好的安全性和抗病毒活性。在该研究中共有175名儿童参与，中位年龄4.8个月，在症状出现后平均3.3 d开始接受药物治疗。研究发现，ALX-0171 3 mg·kg-1组（14.2 h）、6 mg·kg-1组（5.1 h）和9 mg·kg-1组（5.1 h）的病毒载量下降到量化限值以下的中位时间明显少于安慰剂组（46.1 h）［41］。上海洛启生物医药技术有限公司利用自主创建的纳米抗体核心技术平台，开展SARSCoV-2纳米抗体研发。从380多个分子中筛选出7个候选分子并进行真病毒中和活性验证，结果发现，其中候选分子LQ050真病毒中和活性最高，EC50约为3.7 nmol·L-1。同时，LQ050可有效阻断多种冠状病毒如SARS病毒和不同SARS-CoV-2突变体与血管紧张素转换酶2的结合，具有一定的临床开发价值［42］。

在肿瘤治疗方面，纳米抗体可用于直接针对靶标的治疗、用作新型药物递送载体、用于放射性核素与光动力联合的放射免疫疗法或者修饰免疫效应细胞发挥抗肿瘤作用等［43］。以靶向程序性细胞死亡蛋白1（programmed cell death protein-1，PD-1）及其配体（PD-1 ligand，PD-L1）的单抗为代表的免疫检查点抑制剂，在肿瘤治疗领域取得一定进展。其中，先声药业联合苏州康宁杰瑞公司研发的PD-L1纳米抗体恩弗利单抗（envafolimab，KN035）是全球首个进入临床开发的PD-L1纳米抗体，目前在中国、美国和日本已针对多个肿瘤适应证开展临床试验，显示出良好的抗肿瘤活性和安全性，并已获美国食品药品监督管理局授予治疗晚期胆道癌的孤儿药资格。非临床研究结果显示，恩弗利单抗可有效诱导T细胞的细胞因子分泌，在相似剂量下，其抗肿瘤活性强于已上市PD-L1单抗德瓦鲁单抗（durvalumab）。Ⅰ和Ⅱ期临床试验结果显示，恩弗利单抗对肺癌、肝癌、胆管癌、微卫星不稳定性/错配修复功能缺陷晚期实体瘤在内的多种晚期实体瘤患者，具有良好的抗肿瘤活性［44］。Liu等［45］将纳米抗体定点修饰于铁蛋白表面，获得具有肿瘤靶向作用的纳米抗体-铁蛋白偶联物。利用铁蛋白空腔的负载功能，可以载入疏水性的光敏试剂，构建特异性靶向肿瘤细胞的纳米抗体-铁蛋白光动力治疗平台，为构建纳米抗体靶向药物递送系统提供了一种策略。

近年来，纳米抗体药物的研发备受关注，Ablynx公司将纳米抗体药物的开发推到了全新高度。自2007年，该公司研发的卡普赛珠单抗成为首个进入临床研究的纳米抗体，迄今该公司已有超40项纳米抗体药物的在研项目［46］。为了解目前处于临床研发阶段的纳米抗体，通过对ClinicalTrial.gov等数据库和文献的检索，汇总了部分处于不同临床研究阶段（不包括已公布终止临床试验的）的纳米抗体类药物研究情况（表7）。

4 展望

自发现纳米抗体以来，纳米抗体以其结构简单、相对分子质量小、具有与特异抗原亲和力高、稳定性强、易于重组改造、给药途径多元、使用方便、成本低等优点，结合噬菌体展示技术，已成为感染性疾病、肿瘤类疾病和免疫类疾病预防、诊断和治疗领域的研究热点。同时，通过对纳米抗体进行基因工程改造，将其制备成双特异性、多特异性、融合型纳米抗体，从而克服纳米抗体本身半衰期短等不足，也是研究者们不断努力的方向。我国关于抗体药物的研究和开发起步较晚，目前我国抗体药物创新及产业与国际先进水平相比尚存在一定差距。同时，全球SARS-CoV-2疫情形势依然严峻，重大新发突发传染性疾病严重威胁人类健康，这对全球传染性疾病防治也提出了更高要求。纳米抗体以其独特的优势，为传染病防治提供了新的思路和突破口。因此，加强纳米抗体相关基础研究，推进相关成果转化为临床产品，应用于重大慢性疾病或传染性疾病的诊治，对于促进抗体产业发展、完备国家医药储备及维护人民生命健康具有重要意义。