怀玉山高山马铃薯胁迫相关蛋白基因的克隆和序列分析

洪森荣，余淑铃，曾欣怡，赵海玲，郑怡婷，周 军，朱金晶，朱丽倩，蔡 红，陈荣华，

（1.上饶师范学院生命科学学院，江西 上饶334001；2.上饶市红日农业开发有限公司，江西 上饶334700）

马铃薯在世界上是仅次于水稻、小麦、玉米的第4大粮食作物[1].高山马铃薯具有食用价值和营养价值高、种植成本和栽培技术要求低的优点，且高山马铃薯适应高海拔环境能力强，对高山土壤的肥力、酸碱度、坡度、湿度以及光照等逆境胁迫容易耐受，可在山区、丘陵缓坡进行大面积推广种植[2].因此，高山马铃薯的产业化潜力优势十分明显.怀玉山高山马铃薯，俗名麻籽洋芋，是上饶市玉山县怀玉山乡国家地理标志农产品，营养十分全面，且不含还原糖，适合“高血脂、高血压、高血糖”三高人群食用，药食兼优[3].怀玉山高山马铃薯与其他高山马铃薯不同之处在于该物种只能适合于高山高海拔地区种植，一旦将其移种于平原地区，将会产生变种现象，外形变大，品质和风味与原有品种相差甚远.

本课题组对怀玉山高山马铃薯正常种及其变种进行转录组分析，结果发现一个转录本在正常种中上调，在变种中下调，其qRT-PCR检测也进一步验证了转录组结果的准确性，说明该转录本响应逆境胁迫.通过克隆、序列比对发现该转录本编码胁迫相关蛋白（stress related protein）.为了更深入了解怀玉山高山马铃薯胁迫相关蛋白基因的功能，本研究克隆了该蛋白的基因，并对其蛋白序列进行了分析，为深入研究该基因参与怀玉山高山马铃薯抗逆调控的机理提供实验基础.

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

试剂：M-MLVcDNA第一链合成试剂、PrimeScriptRT Reagent Kit With gDNA Eraser（Perfect Real Time）、PMD18-T vector及SYBRPremix Ex TaqTMⅡ，日本TaKaRa公司；Gel Extraction Kit，美国Omega公司；Trizol总RNA提取试剂、PCR反应2×GoldStarTaq-MasterMix，北京康为世纪生物科技有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成.

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取和cDNA第一链合成

用Trizol试剂提取怀玉山高山马铃薯试管苗的总RNA，参照文献[3]，对浓度和完整性进行检测.以RNA为模版，按照M-MLV cDNA第一链合成试剂盒说明书合成cDNA第一链，以Oligo（dT）18 Primer：5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′为逆转录引物，具体操作参照说明书.

1.2.2 怀玉山高山马铃薯胁迫相关蛋白基因的克隆

从试管苗转录组数据库中筛选到胁迫相关蛋白基因的核心片段，利用Primer Premier 5.0设计基因特异性引物（F：ATGGCCGAAACAAACCCTAAG；R：TTAGCTGGAAGCCACAGGCTG）.PCR扩增条件：95℃2 min；95℃30 s，58℃30 s，72℃45 s，35个循环；72℃10 min.用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，将含有目的基因的条带与pMD19-T载体进行连接，采用热激法，将连接产物转化到感受态细胞E.coliDH5α中，对鉴定正确的阳性转化子进行质粒提取，送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序.

1.2.3 怀玉山高山马铃薯胁迫相关蛋白基因的生物信息学分析

参照文献[4]中的方法，分析怀玉山高山马铃薯胁迫相关蛋白的氨基酸序列和理化性质，预测蛋白结构，分析进化关系.使用BioEdit软件将基因序列翻译为氨基酸序列，用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）预测蛋白的理化性质，用ProtScale（https：//web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl）预 测 蛋 白疏/亲水性.使用GORIV软件（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html）预测蛋白质的二级结构.使用SWISS-MOLD（http：//www.swissmodel.expasy.org/interac）预测蛋白质的三级结构.

2 结果与分析

2.1 怀玉山高山马铃薯胁迫相关蛋白一级结构分析

2.1.1 胁迫相关蛋白基因的cDNA序列

正好，在“第二次宁都会议”结束后，毛泽东重返瑞金，途经大柏地时巧遇了一场大雨。雨过天晴，在斜阳辉映下，一碧如洗的天空悬挂着一抹绚丽的彩虹；碧空下的群山延绵起伏、苍翠欲滴。开阔壮美的景象激荡着毛泽东的内心。古语云“不平则鸣，以舒其愤”，富有文学才情和诗人气质的毛泽东，瞬间把心中的块垒化作充满浪漫色彩的“天问”：“赤橙黄绿青蓝紫，谁持彩练当空舞？”词的开篇以反诘的语气发问，极具强烈的感情色彩，畅快地释放了作者心底的情绪。这首词就是在这样的内因驱动和外因诱导下写就的，不仅使作者达到新的心理平衡，而且令作者的心境更加开阔、高远。

怀玉山高山马铃薯胁迫相关蛋白基因的cDNA总长度为681 bp，具体碱基组成如图1（a）所示，各碱基的比例如图1（b）所示，G+C含量为47.58%.

图1 胁迫相关蛋白基因的cDNA序列分析Fig.1 Analysis on cDNA consequence of stress related protein gene

2.1.2 胁迫相关蛋白的氨基酸序列

利用ProtParam预测怀玉山高山马铃薯胁迫相关蛋白的氨基酸序列，结果如图2所示.

图2 胁迫相关蛋白的氨基酸序列Fig.2 Amino acid sequence of the stress related protein

由图2可以看出，怀玉山高山马铃薯胁迫相关蛋白由226个氨基酸组成.该蛋白的相对分子质量为24 781.71，等电点为9.16，是亲水性蛋白.各氨基酸的数目和比例：Ala（A）（29，12.8%）、Arg（R）（6，2.7%）、Asn（N）（4，1.8%）、Asp（D）（5，2.2%）、Cys（C）（1，0.4%）、Gln（Q）（13，5.8%）、Glu（E）（16，7.1%）、Gly（G）（10，4.4%）、His（H）（2，0.9%）、Ile（I）（5，2.2%）、Leu（L）（11，4.9%）、Lys（K）（21，9.3%）、Met（M）（7，3.1%）、Phe（F）（6，2.7%）、Pro（P）（18，8.0%）、Ser（S）（12，5.3%）、Thr（T）（13，5.8%）、Trp（W）（1，0.4%）、Tyr（Y）（14，6.2%）、Val（V）（32，14.2%）、Pyl（O）（0，0%）、Sec（U）（0，0%）.带负电荷残基总数（Asp+Glu）为21，正电荷残基总数（Arg+Lys）为27.原子组成：碳（C）1 125，氢（H）1 779，氮（N）287，氧（O）325，硫（S）8.分子式为C1125H1779N287O325S8，原子总数为3 524.

2.1.3 胁迫相关蛋白的亲、疏水性分析

对怀玉山高山马铃薯胁迫相关蛋白进行亲、疏水性分析，结果如图3所示.图中高峰值（正值）表示疏水区域，低谷（负值）表示亲水区域.由图3可以看出，胁迫相关蛋白的最大疏水值约为2.5，说明该处的疏水性最强，亲水峰最大值约为-2.5.总平均亲水性为-0.157.因此，蛋白质整体呈现高度亲水性，即为亲水性蛋白质.

图3 胁迫相关蛋白亲、疏水值分布Fig.3 Distribution of relative and sparse water values of the stress related protein

2.2 怀玉山高山马铃薯胁迫相关蛋白二级结构分析

利用GOR IV软件对怀玉山高山马铃薯胁迫相关蛋白的二级结构进行预测，结果如图4所示.由图4可知，蛋白二级结构由α-螺旋（alpha helix，42.48%）、β-片层（extended strand，15.93%）、无规则卷曲（random coil，41.59%）构成.从分布位点来看，C端含无规则卷曲，N端含β-片层和无规则卷曲，无规则卷曲、β-片层和α-螺旋也散布于整个蛋白质中.

图4 胁迫相关蛋白的二级结构Fig.4 Secondary structure of the stress related protein

2.3 怀玉山高山马铃薯胁迫相关蛋白三级结构分析

利用SWISS-MODEL预测怀玉山高山马铃薯胁迫相关蛋白的三级结构，结果如图5所示.由图5可知，蛋白的三级结构为二聚体.

图5 胁迫相关蛋白的三级结构Fig.5 Tertiary structure of the stress related protein

2.4 怀玉山高山马铃薯胁迫相关蛋白亚细胞定位

利用Psort在线软件对胁迫相关蛋白基因的表达部位进行预测，结果如图6所示.

图6 胁迫相关蛋白的亚细胞定位Fig.6 Subcellular localization of the stress related protein

由图6可知，定位于细胞核中的胁迫相关蛋白基因数量为4个，叶绿体中为3个，细胞质中为3个，线粒体中为2个，细胞外为2个.这表明该蛋白主要存在于细胞核、叶绿体、细胞质、线粒体和细胞外.

2.5 怀玉山高山马铃薯胁迫相关蛋白系统进化分析

构建怀玉山高山马铃薯胁迫相关蛋白的进化树，结果如图7所示.由图7可以看出，怀玉山高山马铃薯与马铃薯（Solanum tuberosum）胁迫相关蛋白（stress related protein）、野生种潘那利番茄（Solanum pennellii）类胁迫相关蛋白（stress related protein-like）、野生种潘那利番茄胁迫相关蛋白亚型X2（stress related protein isoform X2）、野生种潘那利番茄胁迫相关蛋白亚型X1（stress related protein isoform X1）、智利番茄（Solanum chilense）假设蛋白EJD97008208（hypothetical protein EJD97008208）、番茄（Solanum lycopersicum）类REF/SRPP蛋白At3g-05500亚型X1（REF/SRPP-like protein At3g-05500 isoform X1）在一个大分支下，这说明怀玉山高山马铃薯胁迫相关蛋白在进化上与马铃薯、野生种潘那利番茄、智利番茄和番茄的亲缘关系较近，尤其是与马铃薯胁迫相关蛋白在进化上亲缘关系最近.

图7 胁迫相关蛋白的系统进化分析Fig.7 Phylogenetic analysis of the stress related protein

2.6 怀玉山高山马铃薯胁迫相关蛋白同源蛋白的序列比对信息

怀玉山高山马铃薯胁迫相关蛋白同源蛋白的序列比对信息如图8所示.图中※号区域是该蛋白家族的保守结构域.

图8 胁迫相关蛋白同源蛋白的序列比对Fig.8 Sequence alignment of homologous proteins of stress related protein

3 讨论与结论

目前胁迫相关基因（如感受和传导胁迫信号的蛋白激酶）、转录因子（由信号传导和调控基因表达）以及一些提高植物抗性的功能基因的研究较多[5].研究表明，许多基因受各种逆境胁迫（干旱、低温、高盐等）诱导会产生一些重要的功能蛋白和调控蛋白，这些功能蛋白和调控蛋白对细胞代谢活动的维持具有重要意义[6].如OsiSAP8是一个能够被高温、低温、高盐、干旱、涝、伤害、重金属和ABA诱导的基因，能显著提高转基因烟草和水稻的逆境抗性[7]；NPK1过表达可激活一个氧化信号级联反应，提高转基因玉米的逆境抗性[8]；拟南芥耐盐蛋白（STO）是一种对酵母细胞具有耐盐性的蛋白质，在拟南芥植株光敏色素和蓝光信号中起负调节作用，并参与了黄化过程中苯基苯乙烯酮合酶（CHS）表达的调控[9].本研究中，怀玉山高山马铃薯胁迫相关蛋白基因cDNA总长度为681bp，G+C含量为47.58%，胁迫相关蛋白由226个氨基酸组成，相对分子质量为24 781.71，等电点为9.16，是亲水性蛋白.怀玉山高山马铃薯胁迫相关蛋白二级结构由α-螺旋（42.48%）、β-片层（15.93%）、无规则卷曲（41.59%）构成，C端含无规则卷曲，N端含β-片层和无规则卷曲，且无规则卷曲、β-片层和α-螺旋散布于整个蛋白质中.三级结构为二聚体.怀玉山高山马铃薯胁迫相关蛋白主要存在于细胞核、叶绿体、细胞质、线粒体和细胞外.

蛋白质的生物合成需要起动因子、延伸因子、终止因子、核糖体、信使RNA、氨酰合成酶和tRNA等多种生物大分子的协同作用[10].存在于真核细胞内的延伸因子，其功能是催化氨基酸链在核糖体上的延伸，是一个重要的翻译因子，表达调控保守，其表达水平与细胞生长和分裂相关[11].延长因子是可诱导表达的蛋白，逆境胁迫可诱导延长因子基因的表达[12].本研究构建的进化树表明，怀玉山高山马铃薯与马铃薯的胁迫相关蛋白、野生种潘那利番茄的类胁迫相关蛋白、胁迫相关蛋白亚型X2和亚型X1、智利番茄假设蛋白EJD97008208、番茄类REF/SRPP蛋白At3g05500亚型X1在一个大分支下，与马铃薯胁迫相关蛋白在进化上亲缘关系最近，且与番茄类REF/SRPP蛋白At3g-05500亚型X1功能相似.橡胶粒子可合成与贮存天然橡胶，一般有小橡胶粒子（small rubber particles，SRPs）和大橡胶粒子（large rubber particles，LRPs）之分.橡胶延伸因子（rubber elongation factor，REF）和小橡胶粒子蛋白（SRP protein，SRPP）为橡胶粒子的膜蛋白，是橡胶生物合成的关键蛋白[13].经系统进化关系研究发现，REF和SRPP均属植物胁迫相关蛋白REF家族[14]，同源性达72%，具有保守的REF结构域，REF家族成员在多种植物中都有发现，是一类胁迫相关蛋白，表达受一些外界刺激或激素的调控，在抵御逆境胁迫的生理过程中可能具有重要功能[15-17].怀玉山高山马铃薯与马铃薯胁迫相关蛋白可能属于类REF/SRPP蛋白，在高山高海拔生境中可能作为某种抗逆蛋白发挥作用.怀玉山高山马铃薯高山正常种与平原变种的转录组分析也证明怀玉山高山马铃薯胁迫相关蛋白基因在高山正常种中上调，在平原变种中下调.说明怀玉山高山马铃薯胁迫相关蛋白在植物抵御逆境胁迫的生理反应中起着重要作用.