猪源性大肠杆菌的分离鉴定及菌株耐药性分析

孙伟，刘杉杉,2 *，张睦坚，陆佳，杨再锦，王倩

（1.铜仁职业技术学院贵州铜仁 554300；2.民族中兽药分离纯化技术国家地方联合工程研究中心贵州铜仁 554300）

大肠杆菌是分布最广、分离率最高的革兰氏阴性菌。通常在机体抵抗力下降的时候，大肠杆菌作为一类机会性致病菌，可引起腹泻病（肠内毒性大肠杆菌）、肠外感染（肠外致病性大肠杆菌）、全身感染、毒性（产肠毒素大肠杆菌）和严重的败血综合征，甚至导致人和动物死亡，已成为全球关注的问题[1]。大肠杆菌血清学众多，临床上，通常采用抗菌药对猪场中大肠杆菌引起的疾病进行治疗。然而，养猪生产过程中，抗生素不科学使用导致的耐药菌株出现的问题还十分严重。这些耐药菌种通过水源、食品等多种途径，严重破坏猪群正常肠道菌群的平衡，对养猪业来说是一种隐患，同时也威胁着人类的健康。目前，我国已经学者已经在多个规模化猪场中分离到了多种耐药菌种[2,3]，提示抗菌药物滥用造成的后果严重。

针对抗菌药物在铜仁市规模化养殖场耐药情况的相关研究报道较为少见。因此，为了初步了解铜仁市养殖场大肠杆菌耐药情况，本研究选取笔者服务的某猪场，分别采集成年猪和仔猪肛门拭子，从中分离大肠杆菌，并选取常见治疗用药物，进行耐药性分析，旨在为科学用药提供一定的指导。

1 材料方法

1.1 主要试剂

无菌采样管（HBPT034-2）、大肠杆菌成套检测试剂（SHBG16）、伊红美蓝琼脂平板（HBPM007）、革兰氏染色液试剂盒（HB8278），LB 肉汤培养基均购自青岛海博生物科技有限公司。头孢噻吩、四环素、环丙沙星、庆大霉素、萘啶酸和氧氟沙星等药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司。引物通过Ologo 7.0 软件设计并送往上海生工合成。

1.2 样品的采集与处理

在铜仁市某猪场通过采集仔猪和成年猪肛门拭子获取样品，并接种到无菌的肉汤培养基中扩增培养。

1.3 细菌分离、纯化

将扩增培养后的菌体，均匀涂布在伊红美蓝培养基上，37℃恒温培养培养12～16h。无菌操作，挑取金属光泽的菌落，划线后进行纯培养，挑取单菌落置于L 液体培养基中扩增培养。

1.4 细菌革兰氏染色

按照说明书操作进行革兰氏染色。接种环取环菌液，置于干净的载玻片上。经自然干燥或是酒精固定后，滴加一滴结晶紫染液，约1min 后，清水冲洗，干燥后滴加碘液进行媒染，，同样经水洗后，经95%乙醇溶液脱色，滴加番红染液进行复染。水洗后，待玻片自然干燥后，于油镜下观察细菌形态和着色情况。

1.5 大肠杆菌基因鉴定

参考文献[4]，利用细菌16S rDNA 通用引物进行目标基因片段扩增，引物具体信息见表1。

表1 引物序列

1.6 药敏试验

取200μL 扩增培养后的菌液，均匀涂布在LB 固体培养基表层。待菌液完全吸收后，经待检药敏片吸附在培养基上，于37℃培养箱中倒置培养12～16h。根据欧盟药品试验标准委员会推荐的琼脂培养法，测量抑菌圈直径大小，并参考欧盟药敏试验标准，以此来判定细菌对药物的敏感性[5]。

2 结果

2.1 大肠杆菌分离鉴定

采集的肛门拭子样品，在伊红美蓝琼脂培养基上，呈现带金属光泽的菌落。经革兰氏染色，结果均为红色的短杆菌。并经PCR 扩增出阳性菌落，对其基因进行测序，结果表明成功分离到2 株猪源性大肠杆菌，分别命名为P1 和P2 样品。

2.2 药敏试验

通过测定抑菌圈直径，并根据已知标准，判断P1 和P2 菌株对药物的敏感度。结果表明，不同年龄猪只分离出来的大肠杆菌耐药性具有一定的差异。P1 菌株对环丙沙星抑菌圈直径为19mm，提示对该药物高度敏感；而对氧氟沙星、头孢噻吩中度敏感，抑菌圈直径显示分别为15mm 和11mm；对四环素、磺胺嘧啶、庆大霉素具有耐药性，所测得的抑菌圈直径均在10mm 以下。P2 菌株对抗菌药物的敏感度则有很大差异，表现出对萘啶酸和氧氟沙星中度敏感，抑菌圈直径分别为15mm 和13mm；而对四环素、环丙沙星和和氧氟沙星抑菌圈直径均在8～9mm 之间，具有耐药性。

3 讨论

大肠杆菌是一种常见于哺乳动物肠道的共生微生物，当它携带有某些毒力基因或具有其他特性（如抗微生物基因）时，有可能会对人和动物体具有致病性[6]。耐多药大肠杆菌能引起多种疾病，给养猪业带来巨大的经济损失。抗菌剂的应用主要用于促进生长、预防和治疗疾病。科学界普遍公认的观点是，在动物生产中使用抗菌剂是导致抗药性细菌（如大肠杆菌、沙门氏菌等）逐渐增加的主要原因之一。猪肉占世界肉类供应总量的36%[7]，中国又是世界上最大的猪肉消费国。因此，耐药菌株的增加关系到食品安全问题。

大肠杆菌具有沿着食物链转移的潜力，且易于分离、易于获得并稳定遗传等特性，可成为一种适合于研究耐药特性候选菌种。本研究中发现，从健康的猪只体内分离到的P1 菌株对四环素、磺胺嘧啶、庆大霉素具有较强的耐药性，而P2 菌株则对四环素、环丙沙星和和氧氟沙星具耐药性较强。这说明，铜仁市区内猪场已经有多重耐药菌株的存在。因此，有必要做进一步的调研研究，才能科学指导养殖场规范使用抗生素，减少对猪群甚至是人类食品安全的影响。